一種提高絲狀真菌纖維素酶產量和木質纖維素降解利用的菌株構建方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，一種高效表達生產纖維素酶和提升木質纖維素降解能力的方法，主要涉及一個纖維寡糖轉運類似蛋白CLPl (NCU05853)在粗糙脈孢菌纖維素酶誘導表達和它在纖維二糖轉運中的作用的發現，以及NCU05853同一個纖維寡糖轉運蛋白NCU008114和三個β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755的組合基因突變菌株的構建和纖維素酶產酶，以及利用NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白NCU08114同三個β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755及碳代謝阻遏蛋白CREl (NCU08807)的系列突變菌株作為基礎菌株構建的其他菌株提升微生物產纖維素酶和木質纖維素降解能力。
【背景技術】
[0002]隨著化石燃料，例如石油的不斷挖掘，逐漸枯竭，以及對環境造成的污染等問題，尋找新的替代能源迫在眉睫，利用大量廉價的生物質(木質纖維素)作為原料發酵生產生物燃料一直是近年的研究熱點。以木質纖維素為原料的生物煉制主要有三個步驟:預處理，酶解和糖利用。其中酶解是生物煉制過程中的一個重要的部分，也是需要解決的一個瓶頸問題。
[0003]木質纖維素的結構和成分復雜，其主要是由纖維素、半纖維素、果膠以及酚醛聚合物木質素所組成。纖維素主要是由D-葡萄糖單元通過β_1，4鍵連接成的線性多聚葡萄糖鏈。在結晶纖維素中，這些多聚鏈通過氫鍵包裹形成高度不溶的結構。半纖維素是自然界中僅次于纖維素的豐富的多聚物，其結構比纖維素更加復雜，由不同糖單元組成。木質纖維素的復雜成分及結構決定了其降解需要一系列的酶協同作用下來完成，其中纖維素完全降解為葡萄糖需要外切葡聚糖酶，也稱為纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91 ;1，4-β -D-glucancellob1hydrolases),從多聚物的尾部水解出纖維二糖;內切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4 ;1，4-β -D-glucan-4-glucanohydrolase),主要是從纖維素鏈的內部無定型區域酶切，為外切葡聚糖酶提供更多的作用位點。β -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)將纖維二糖水解成葡萄糖。
[0004]自然界中很多微生物可以生產纖維素酶去降解木質纖維素，例如很多絲狀真菌。但大多數野生型絲狀真菌生產的纖維素酶對于木質纖維素的水解效率無法達到工業生產水平，因此這些真菌被改造，從而提高纖維素酶的產量以及水解效率。真菌菌種改造，一方面是傳統誘變，工作量大，當菌種達到一定程度后，再使用傳統誘變的方法進行改造，上升空間有限。另一方面是通過機理研究使用分子手段的理性改造。通過改造一個或多個基因來達到提高纖維素酶的目的。改造基因的選擇是最終能否提高菌株纖維素酶的關鍵因素。
【發明內容】
[0005]本發明的主要目的是提供一種提高真菌產纖維素酶和提升纖維素降解利用的菌種改造方法，核心發明點是首次發現一個纖維寡糖轉運蛋白類似蛋白CLP1(NCU05853)的功能是抑制纖維寡糖轉運，通過組合改造(敲除、突變等)微生物的纖維寡糖轉運類似蛋白CLPl和纖維寡糖轉運蛋白以及β_葡萄糖苷酶基因和碳代謝阻遏基因CREl(NCU08807)，得到多個纖維素酶顯著提升的組合突變體.尤其是5突變菌株(CPL7:Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853), 6 突變菌株(CPL9: Λ 3 β G Λ cdt2 Λ ncu05853 Λ crel)纖維素酶產酶和纖維素降解利用能力顯著提升。本發明包括但不限于該5突變體和6突變體的系列組合突變可以用來發酵生產纖維素酶和利用纖維素生產生物基化學品。
[0006]第一方面，本發明提供用于生產纖維素酶的多基因突變菌株，能夠在纖維二糖以及纖維素誘導條件下表達含纖維二糖水解酶CBHl和CBH2在內的纖維素酶系；為以下菌株之一:
a.命名為CPL7( A30GAcdt2AncuO5853)的基因突變菌株，是敲除纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)以及β-葡萄糖苷酶基因NCU00130.NCU04952 和 NCU08755 的微生物菌株；
b.命名為CPL9( A30GAcdt2AncuO5853Acrel)，是敲除纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的微生物菌株；
c.命名為CPLlO( A2PGAcdt2Ancu05853)，是敲除纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)以及β -葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU08755的微生物菌株；
d.命名為CPLll( A20GAcdt2AncuO5853Acrel)，是敲除纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU08755以及碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的微生物菌株；
所述微生物為脈抱菌iNeurospora )、曲霉(Aspergillus )、木霉(Trichoderma )、青霉{Penicillium )、鐮刀霉iFusarium)或側孢霉iSporo trichum );優選為粗糙脈孢菌iNeurospora crassa)。
[0007]所述纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T_2 (NCU08114)以及葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列及其編碼蛋白的氨基酸殘基序列如下:
1)纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853的核苷酸序列如序列表中SEQID N0.1所示；纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.2所示；
2)纖維寡糖轉運蛋白NCU08114的核苷酸序列如序列表中SEQID N0.3所示；纖維寡糖轉運蛋白NCU08114編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.4所示；
3)β -葡萄糖苷酶基因NCU00130的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU00130編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.6所示；
4)β -葡萄糖苷酶基因NCU04952的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.7所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU04952編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.8所示；
5)β -葡萄糖苷酶基因NCU08755的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.9所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU08755編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.10所示。
[0008]6)碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.11所示；碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.12所示。
[0009]構建上述多基因突變菌株的方法，包括敲除微生物中纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)中的不同組合；該過程可以通過不同單突變體的依次雜交來獲得。
[0010]以上分別列出了本發明的技術方案。總體而言，本發明采用粗糙脈孢菌(又稱脈孢霉)系統，該菌具有較為完善的遺傳操作系統和大量的基因突變體庫，功能基因組資源及其豐富，而且該菌有性雜交技術簡單，便于操作，使得該菌非常易于進行分子改造，是纖維素酶研究的優秀體系。研究表明，本發明利用研究的非常透徹的模式真菌粗糙脈孢菌體系，其生長速度非常快，固體平板上，25度條件下，其菌絲24小時可以達到7厘米，顯著快于其他絲狀真菌如曲霉、木霉等，而且該菌遺傳操作工具成熟，便于分子改造。本發明采用清晰的遺傳操作等分子生物學技術，構建了一系列突變體工程菌株，可重復性高，技術路線清晰，并且能夠在本發明基礎上繼續改造提升。本發明構建的菌株能夠利用纖維二糖、纖維素等作為誘導物生產纖維素酶，比目前誘導物(槐糖等)生產成本低。本發明具有以下優點:
通過真菌雜交方法構建多個組合突變體(包括敲除纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的不同組合所得菌株)的多基因突變體菌株，該系列多基因突變體菌株不僅能夠以纖維二糖，還可以以纖維素為誘導物表達生產纖維素酶，提升木質纖維素降解能力(可用于提升以木質纖維素為底物生產化學品微生物構建)，降低纖維素酶成本和生物質為原料的化學品生產成本。
[0011]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0012]
【附圖說明】
[0013]圖1:多基因突變體在斜面上的生長
圖2:多基因突變體在2%纖維二糖誘導條件下發酵上清中的蛋白分泌(A)和纖維素酶生產(B)
圖3:多基因突變體在2%纖維素誘導條件下發酵上清中的蛋白分泌(A)和纖維素酶生產(B)
圖4:多基因突變體在2%纖維二糖以及2%纖維素誘導條件下發酵上清的SDS-PAGE圖圖5:多基因突變體纖維二糖轉運速率(A)和多基因突變體中纖維寡糖轉運蛋白基因在2%纖維二糖誘導條件下的表達(B)
圖6:高產纖維素酶多基因突變體菌株CPL7在纖維二糖條件下的轉錄組分析上調表達大于等于2倍的1309個基因的聚類圖(Α)，804個基因的funcat分析圖(B)，804個基因中的主要纖維素酶相關基因的表達水平圖(C)，804個基因中的纖維素酶和半纖維素酶相關轉錄因子基因表達水平圖(D)以及纖維寡糖轉運蛋白基因表達水平圖(E)
圖7高產突變體CPL9 ( A3PGAcdt2Ancu05853Acrel)在纖維二糖誘導條件下的蛋白產量
圖8高產突變體CPL9 ( A30GAcdt2AncuO5853Acrel)在纖維二糖誘導條件下的纖維素酶酶活(CMCase activity)。
[0014]圖9高產突變體CPLlO ( A20GAcdt2AncuO5853)在纖維二糖和纖維素誘導條件下的蛋白產量。
[0015]圖10高產突變體CPLlO ( A20GAcdt2AncuO5853)在纖維二糖誘導條件下的纖維素酶基因(NCU07340)和半纖維素酶相關轉錄因子(NCU06971)基因的表達水平
【具體實施方式】
[0016]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見:《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David I ,Molec μ Iar Cloning: A Laboratory Manual,3rd edit1n，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所出現的百分比濃度如無特別說明均為質量百分濃度。
[0017]實施例中描述到的的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。
[0018]實施例中所采用的原始出發菌株和部分原始單基因敲除菌株均購買于美國真菌遺傳資源中心(Fungal Genetics Stock Center,縮寫FGSC)真菌菌種保存庫,為商業渠道獲得。各自FGSC編