6mg/L，磷酸二氫鉀40mg/L，碳酸鈉20mg/L，梓檬酸6mg/L，梓檬酸鐵錢3mg/L，乙二胺四乙酸鈉lmg/L，七水硫酸鋅0.22mg/L，五水硫酸銅0.08mg/L，四水氯化錳1.8 lmg/L，二水鉬酸鈉0.39mg/L，六水硝酸鈷0.05mg/L，硼酸2.86mg/L)，于25 °C、持續光強為60μπιο1 m—Y1條件下培養3天可獲得游動細胞占細胞總數85 %的培養物。
[0030]配制含0.5mM〇&(:12，0.21山梨醇/甘露醇，0.051 Tris-HCl(pH 7.8)的緩沖液，加入膠原蛋白酶(Collagenase IV)至終濃度為0.2% (m/v)，將上述制備的游動細胞以3 X 15個/ml的密度重懸于酶解緩沖液中，控制溫度在35°C、搖動速度10rpm下酶解45min，原生質體得率可達84 %。
[0031]實施例2
[0032]雨生紅球藻(NIES-144)不動細胞接種于與實施例1中無機營養相同的培養基中，乙酸鈉和酵母提取物的濃度分別為3g/L和0.5g/L，于25°C、持續光強為30μπιΟ1 Hf2iT1條件下培養3天可獲得游動細胞占細胞總數90%的培養物。
[0033]將細胞以I X 15個/ml的細胞密度，重懸在含有0.4%膠原蛋白酶(CollagenaseΙΠ)、0.5πιΜ〇&(:12，0.21山梨醇/甘露醇，0.051 Tris-HCl(pH 7.8)的酶解緩沖液中，控制溫度在35°C、搖動速度10rpm下酶解30min，原生質體得率可達85%。
[0034]實施例3
[0035]雨生紅球藻(SAG34-lb)不動細胞接種于與實施例1中無機營養相同的培養基中，乙酸鈉和酵母提取物的濃度分別為2g/L和2g/L，于25°C、持續光強為30μπιΟ1 m—iV1條件下培養3天可獲得約90%的游動細胞。
[0036]將細胞以2X 15個/ml的細胞密度，重懸在含有0.6%膠原蛋白酶(CollagenaseI)、0.5mM〇&(:12，0.21山梨醇/甘露醇，0.051 Tris-HCl(pH 7.8)的酶解緩沖液中，控制溫度在35°C、搖動速度10rpm下酶解50min，原生質體得率可達88%。
[0037]以上實施例中，將所用的藻種替換為NIES-144或SAG34_lb等其他株系的雨生紅球藻，或將所用的膠原蛋白酶更換為其他Collagenase I或ΙΠ等膠原蛋白酶所得結果相似。
[0038]對比例I
[0039]將雨生紅球藻(SCCAP K-0084)不動細胞接種于含4g/L乙酸鈉的BGll培養基中，于25°C、持續光強為60μπιΟ1 Hf2s-1條件下培養3天，可獲得游動細胞占細胞總數74%的培養物。
[0040]配制含0.5mM〇&(:12，0.21山梨醇/甘露醇，0.051 Tris-HCl(pH 7.8)的緩沖液，加入膠原蛋白酶(Collagenase IV)至終濃度為0.2% (m/v)，將上述制備的游動細胞以3 X 15個/ml的密度重懸于酶解緩沖液中，控制溫度在35°C、搖動速度10rpm下酶解45min，原生質體得率為72 %。
[0041 ] 對比例2
[0042]將雨生紅球藻(SCCAP K-0084)不動細胞接種于含0.5g/L乙酸鈉和0.3g/L酵母提取物的8611培養基中，于25°(:、持續光強為6(^11101 m—2S.1條件下培養3天可獲得游動細胞占細胞總數78%的培養物。
[0043]配制含0.5mM〇&(:12，0.21山梨醇/甘露醇，0.051 Tris-HCl(pH 7.8)的緩沖液，加入膠原蛋白酶(Collagenase IV)至終濃度為0.2% (m/v)，將上述制備的游動細胞以3 X 15個/ml的密度重懸于酶解緩沖液中，控制溫度在35°C、搖動速度10rpm下酶解45min，原生質體得率可達75%。
[0044]對比例3
[0045]將雨生紅球藻(SCCAP K-0084)不動細胞接種于含0.5g/L乙酸鈉和0.5g/L酵母提取物的8611培養基中，于25°(:、持續光強為6(^11101 m—2S.1條件下培養3天可獲得游動細胞占細胞總數76%的培養物。
[0046]配制含0.5mM〇&(:12，0.21山梨醇/甘露醇，0.051 Tris-HCl(pH 7.8)的緩沖液，加入膠原蛋白酶(Collagenase IV)至終濃度為0.2% (m/v)，將上述制備的游動細胞以3 X 15個/ml的密度重懸于酶解緩沖液中，控制溫度在35°C、搖動速度10rpm下酶解45min，原生質體得率可達73%。
[0047]由上述實施例和對比例可以看出，在BGll培養基中添加乙酸鈉和酵母提取物，可以用于雨生紅球藻生活史中特定的細胞(游動細胞)快速培養富集，并以此為對象進行原生質體的制備。培養基中酵母提取物的加入量是經過多次試驗優化得到的，酵母提取物加入的過多或過少都會影響游動細胞的數量和原生質體的得率，經試驗驗證，在BGll培養基中添加濃度為0.5-3g/L的乙酸鈉和濃度為0.5-3g/L的酵母提取物，其最有利于雨生紅球藻游動細胞的培養和原生質體的制備。
[0048]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術的技術人員在本發明批露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種雨生紅球藻游動細胞的培養方法，其特征在于，包括將雨生紅球藻在含有乙酸鈉、酵母提取物和其他無機營養的培養基中進行培養的步驟。2.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述培養基中，乙酸鈉濃度為0.5-3g/L，酵母提取物濃度為0.5-3g/L。3.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述培養基中，其他無機營養包含:硝酸鈉1000mg/L，七水硫酸鎂75mg/L，二水氯化|丐3611^凡，磷酸二氫鉀40mg/L，碳酸鈉20mg/L，梓檬酸6mg/L，梓檬酸鐵錢3mg/L，乙二胺四乙酸鈉lmg/L，七水硫酸鋅0.22mg/L，五水硫酸銅.0.08mg/L，四水氯化錳1.8lmg/L，二水鉬酸鈉0.39mg/L，六水硝酸鈷0.05mg/L，硼酸2.86mg/L04.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，培養的條件為:培養溫度為20-25°C、光照強度為30-60μηιο1 m—2s—S培養時間為3_6天。5.—種利用權利要求1所述的培養方法得到的游動細胞制備原生質體的方法，其特征在于，包括:將雨生紅球藻的游動細胞以一定初始密度重懸于含有膠原蛋白酶的緩沖液中進行酶解的步驟和制備雨生紅球藻原生質體懸液的步驟。6.如權利要求5所述的制備原生質體的方法，其特征在于，所述膠原蛋白酶選自膠原蛋白酶I，II，III或IV類型。7.如權利要求5所述的制備原生質體的方法，其特征在于，所述膠原蛋白酶的濃度為.0.2-0.6%8.如權利要求5所述的制備原生質體的方法，其特征在于，所述酶解的條件為:在35± IT^PlOOrpm轉速下酶解15-60分鐘。9.如權利要求5所述的制備原生質體的方法，其特征在于，緩沖液中主要成分為:0.5mMCaCh，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05M Tris-HCl，pH 7.8。10.如權利要求5所述的制備原生質體的方法，其特征在于，游動細胞的初始密度為.0.5-3 X 15個/ml
【專利摘要】本發明提供了一種雨生紅球藻游動細胞的培養方法，包括將雨生紅球藻在含有乙酸鈉、酵母提取物和其他無機營養的培養基中進行培養的步驟。通過具有特定成分的培養基培養可獲得高達85％以上的游動細胞，細胞密度可達105個/ml以上。本發明還提供了一種利用游動細胞制備原生質體的方法，在含有膠原蛋白酶Collagenase的酶溶液中處理后可獲得80％以上的原生質體。本發明的細胞培養與原生質體制備過程操作簡單，方便快捷，具有可重復性，原生質體制備率高，活性保持好，有利于后續的原生質體融合與分子生物學操作等工作。
【IPC分類】C12R1/89, C12N1/12
【公開號】CN105647810
【申請號】
【發明人】徐曉瑩, 程天佑, 張維, 陳林, 劉天中
【申請人】中國科學院青島生物能源與過程研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月8日