pBIG2RHPH2中的HPH表達單 元，進一步構建質粒轉化質粒pBIG2_ura5s。更進一步地在質粒pBIG2_ura5s和質粒pET28a-HPHs的基礎上，構建高山被孢霉基因操作通用載體。用PCR的方法從高山被孢霉基因組中獲 得非編碼的內含子DNA片段IT。用限制性內切酶Nco I和BamH I分別對IT基因片段和質粒 pET28a-HPHs進行酶切，并通過連接反應將IT片段取代質粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到質 粒pET28a-ITs。用限制性內切酶Spe I和Xba I雙酶切質粒pET28a-ITs得到ITs表達單元。將 ITs表達單元插入到Xba I酶切過的質粒pBIG2-ura5s中，得到高山被孢霉基因操作通用載 體pBIG2-ura5s-ITs。然后通過基因工程技術將ω-3脫飽和酶基因插入高山被孢霉通用載 體pBIG2_ura5s_ITs中，構建二元表達載體pBIG2_ura5s-〇PpFADS17。
[0037]在本發明中，所述高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株是已公開的重組高山被孢霉 MAUI (CCFM501 )，其保藏編號為CGMCC No . 8414，該菌株已在中國專利申請CN 201310347934.8 中公開。
[0038] 根據CN 201310347934.8說明書記載，重組高山被孢霉CCFM501是通過失活高山被 孢霉ATCC32222基因組中編碼乳清酸磷酸核糖轉移酶OPRTase的ura5基因構建而成的。其 中，ura5基因的失活是通過缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而實現 的，所使用的同源臂分別是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的 1362bp的片段，具體步驟為：首先獲得ura5敲除基因片段，并進一步構建敲除質粒 pBIG4K0ura5,然后用重組質粒pBIG4K0ura5轉化根癌農桿菌，最后用經轉化的含質粒 pBIG4K0ura5的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉并對轉化后的高山被孢霉進行篩選和鑒定， 獲得尿嘧啶營養缺陷型高山被孢霉MAU1(CCFM501)菌株。
[0039]在本發明中，應用于轉化高山被孢霉的根瘤土壤桿菌為：根瘤土壤桿菌 Agrobacterium tumefaciens C58Cl(Tsuji G , F u j i i S,Fujihara N,e t al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation for random insertional mutagenesis in Colletotrichum lagenarium[J].Journal of General Plant Pathology,2003,69(4) :230-239.),為本領域技術人員可以公開獲得的菌株，在某些文獻 中，它也可能被稱為根癌農桿菌。
[0040]本發明所涉及的Broth培養基，其組成為：20g/L葡萄糖，5g//L酵母提取物，lg/U粦 酸二氫鉀，〇. 25g/L七水硫酸鎂，10g/L硝酸鉀，余量為水，pH 6.0。
[0041 ]本發明所涉及的MM固體培養基，其組成為：1.74g/L磷酸氫二鉀，1.37g/L磷酸二氫 鉀，0.146g/L氯化鈉，0.49g/L七水硫酸鎂，0.078g/L氯化鈣，0.0025g/L七水硫酸亞鐵， 0.53g/L硫酸銨，1.8g/L葡萄糖，0.5 %甘油，20g/L瓊脂，余量為水，pH 6.8。
[0042]本發明所涉及的頂培養基是在MM培養基的基礎上添加了200μΜ的乙酰丁香酮(AS) 構成的。
[0043] 本發明所涉及的SC-CS培養基是添加了濃度為100yg/mL壯觀霉素奇霉素 (Spectinomycin)和濃度為100yg/mL頭抱噻月虧抗生素 （Cefotaxime Sodium)的SC固體培養 基。SC固體培養基組成為:20g/L葡萄糖，5g//L酵母氮源無氨基酸和硫酸銨，1.7g/l硫酸銨， 60mg/L異亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L蘇氨酸，40mg/L賴氨酸，30mg/L酪 氨酸，20mg/lJ泉嘌呤，20π^/1精氨酸，20π^/1組氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L瓊脂，余量為 水，pH 6.8。
[0044] 本發明所涉及的GY-CS培養基是添加了濃度為100yg/mL壯觀霉素奇霉素和濃度為 100yg/mL頭孢噻肟抗生素的GY固體培養基。GY固體培養基組成為:20g/L葡萄糖，10g/L酵母 提取物，2g/L硝酸鉀，lg/L磷酸二氫鈉，3g/L七水硫酸鎂，20g/L瓊脂，余量為水，pH 6.8。
[0045] 本發明在現有的高山被孢霉轉化系統的基礎上，采用根瘤土壤桿菌介導的基因轉 化方法，構建了在高山被孢霉中過表達來源于寄生疫霉的ω -3脫飽和酶基因 oPpFADS 17的 工程菌株。獲得的重組高山被孢霉經過多次傳代，經鑒定〇PpFADS17片段仍穩定存在基因組 中，且菌株的生長特性與原養型菌株無明顯差別，但重組菌的EPA產量達到總脂肪酸的 31.5%，對AA的轉化率高達77.6%，而原始菌株幾乎檢測不到EPA，較其他異源表達ω-3脫 飽和酶基因的重組高山被孢霉、甚至在先申請的過表達來源于瓜果腐霉的ω-3脫飽和酶基 因的高山被孢霉MA-〇PaFADS17-3菌株在ΕΡΑ產量上均得到了顯著提高，進一步推動了產油 真菌產業進步和EPA的工業化生產。
[0046] 本發明的重組高山被孢霉菌株1^-〇???40317-4于2016年1月18日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學 院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 11820。 【【附圖說明】】
[0047] 圖1為二元表達載體pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的構建示意圖；
[0048] 圖2為過表達oPpFADSl7基因的高山被孢霉重組菌株鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖。其 中，Μ為marker; 1:代表陰性對照;2-6:代表1-5號轉化子；
[0049] 圖3為高山被孢霉野生型菌株與5株基因工程菌株ω-3脫飽和酶基因（oPpFADS17) RT-qPCR的結果分析圖。其中，M.alpina為高山被孢霉野生型對照；1-5代表重組菌株1^_ oPpFADS17-l,MA-〇PpFADS17-2,MA-〇PpFADS17-3,MA-〇PpFADS17-4,MA-〇PpFADS17-5〇 【【具體實施方式】】
[0050] 實施例1:酶切反應
[0051] 根據高山被孢霉的密碼子使用偏好性，對來源于天然寄生疫霉的ω-3脫飽和酶基 因的核酸序列(Genbank accession No:ΧΜ_008906963)進行密碼子優化，并且人工合成了 優化后的基因序列〇PpFADS17,如SEQ No.l和2所示。然后與PUC57載體連接得PUC57-oPpFADS17〇
[0052] 在37°C條件下，先用限制性內切酶Hind III過夜酶切質粒PUC57-〇PpFADS17及載 體pBIG2-ura5s-ITs片段，Hind III酶切體系（100yL)為：2yL Hind III-HF，30yL質粒或載 體，l〇yL Cutsmart Buffer，58yL去離子水，37°C孵育 12h〇
[0053] 其中，載體pBIG2-ura5s-Its是根據中國專利申請CN201310524221.4直接獲得的。
[0054] 通過PCR的方法從pD4質粒上獲得HPH表達單元，將HPH表達單元用限制性內切酶 EcoR I和Xba I酶切，插入到EcoR I和Xba I酶切過的pET28a( + )的多克隆位點(MCS)中，得 到質粒pET28a-HPHs。利用PCR從高山被孢霉cDNA中獲得ura5(乳清酸磷酸核糖轉移酶； OPRTase)基因，并利用限制性內切酶BspH I和BamH頂每切ura5基因，將酶切過的ura5基因 插入到Nco I和BamH頂每切過的質粒pET28a-HPHs中，以替換hpt基因，構建質粒pET28a-ura5s。用限制性內切酶EcoR I和Xba I酶切質粒pET28a_ura5s得到ura5s表達單元。將 ura5s表達單元替換質粒pBIG2RHPH2中的HPH表達單元，進一步構建質粒轉化質粒pBIG2-ura5s。更進一步地在質粒pBIG2-ura5s和質粒pET28a-HPHs的基礎上，構建高山被孢霉基因 操作通用載體。用PCR的方法從高山被孢霉基因組中獲得非編碼的內含子DNA片段IT。用限 制性內切酶Ncol和BamHI分別對IT基因片段和質粒pET28a-HPHs進行酶切，并通過連接反應 將IT片段取代質粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到質粒pET28a-ITs。用限制性內切酶Spe I和 Xba I雙酶切質粒pET28a-ITs得到ITs表達單元。將ITs表達單元插入到Xba I酶切過的質粒 pBIG2_ura5s中得到高山被孢霉基因操作通用載體pBIG2_ura5s_ITs。
[0055]回收酶切產物，進一步使用限制性內切酶Xho I單酶切，切膠純化回收目的基因 (ω-3脫飽和酶基因片段oPpFADS17)和載體pBIG2-ura5s-ITs片段。酶切體系為（100μυ:2μ L Xho I，30yL質粒或載體pBIG2_ura5s_ITs片段，10yL cutsmart Buffer，58yL去離子水， 37°C水浴酶切12h。
[0056] 其中，內切酶緩沖液Cutsmart buf f er: 50mM乙酸，20mM Tris-乙酸，10M乙酸儀， 100yg/mL牛血清白蛋白，pH 7.9。
[0057] 實施例2:連接反應
[0058]用T4連接酶將酶切純化后的ω-3脫飽和酶基因片段〇PpFADS17與載體pBIG2-ura5s-ITs連接，4°C連接12h，得到重組表達載體pBIG2-ura5s-〇PpFADS17。連接體系為（10μ L): 2yL目的基因酶切后片段，3yL載體酶切后片段，lyL連接酶buff er，lyL Τ4連接酶，3yL無 菌水，4°C連接12h。
[0059]連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，轉化方法如下：
[0060]⑴