至恒重，稱量菌體重量，計算生物量。
[0119] ⑶將菌體研磨成粉末，稱取50mg，加入2mL 4M鹽酸。
[0120] ⑷ 80 °C 水浴 1 h，-80 °C 放置 15min。重復一次。80 °C 水浴 1 h。
[0121 ] (5)冷卻至室溫，加入lmL甲醇，混勻。
[0122] (6)加入 lmL 氯仿，震蕩 1〇111；[11。3000\8離心3111；[11。收集氯仿。
[0123] ⑵重復(6)兩次。
[0124] (8)合并氯仿(3mL)，加入lmL飽和氯化鈉，混勾，3000 Xg離心3min。收集氯仿層于新 瓶。剩余液體繼續加入lmL氯仿，3000 X g離心3min。合并氯仿(4mL)。
[0125] (9)氮吹干燥，加入lmL乙醚，轉移至潔凈的已經稱重的瓶中。氮吹干燥。
[0126] 實施例8:陽性轉化子脂肪酸檢測
[0127] 脂肪酸組成及含量的測定方法:①向上述粗脂中分別加入100yL 2.02mg/mL內標 C15:0和lmL 10wt%的鹽酸甲醇，60°C水浴3h，每隔30min振蕩lmin;②冷卻至室溫后加入 lmL正己燒和lmL飽和氯化鈉溶液，震蕩混勾，3000 X g離心3min，吸出正己燒層，再加入lmL 正己燒，震蕩混勾，3000 X g離心3min，吸出并合并正己燒;③37 °C氮氣吹干后，加入lmL正己 烷，混勻，轉入氣相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液;④脂肪酸甲酯分析采用GC-2010(Shimadzu Co ·，Japan)，色譜柱為DB_Waxetr(30mX 0 · 32mm，0 · 22μηι)。氫火焰離子檢測器檢測，汽化室 和檢測器溫度分別為240°C和260°C，分流方式進樣lyL，分流比10:1，載氣為氮氣。程序升 溫:初始溫度120 °C保持3min，以5 °C/min升到190 °C，再以4 °C /min升到220 °C，保持20min。通 過與商業化的脂肪酸甲酯標準品（37種脂肪酸甲酯混標，SupelC〇，USA)和加入內標C15:0的 質量比較，定性、定量分析樣品中脂肪酸組分，其中總脂肪酸含量用單位菌體中總脂肪酸的 質量表示。
[0128] 表1是高山被孢霉野生型（原養型）菌株與五株基因工程菌株脂肪酸產量的比較， 表2是高山被孢霉野生型菌株與五株基因工程菌株脂肪酸組成的比較。由表1和表2的結果 可以看出五株基因工程菌株與野生型菌株生物量沒有顯著差異，而脂肪酸組成卻發生了明 顯變化。其中，5株重組菌株中AA(C20:4)的產量較野生型有不同程度的減少，且有大量EPA (C20:5)產生，且AA的減產與EPA的增產有明顯的規律，而其余各種脂肪酸(C16:0、C18:0、 (：18:1、(：18 :2、(：18:3)的產量沒有顯著變化，這說明5株重組菌株都能不同程度地將44催化 為EPA。其中，MA-〇PpFADS17-4表現出特別優秀的EPA產量，其EPA的產量達到1197.3mg/L，占 總脂肪酸(TFA)含量的31.5%，同時其AA產量僅為326.8mg/L，表示能夠將大部分AA催化轉 化為EPA，對AA的轉化率達77.6% (轉化率= EPA/(AA+EPA) X 100% )，此外其總脂肪酸絕對 值也有一定幅度提尚。
[0129] 此外，其余四株重組菌株(MA-〇PpFADS17-l、2、3和5)也表現出不同程度的EPA產量 的提高，以明顯區別于野生型菌株。這表明異源表達的ω-3脫飽和酶基因 〇PpFADS17在高山 被孢霉中能夠成功表達，通過本發明的構建方法得到的重組菌能夠將AA轉化為EPA并具有 相當轉化率。其中，以MA-〇PpFADS17-4效果最為明顯，較其他MA-〇PpFADS17轉化子菌株有意 想不到的提高，也顯著高于其他現有技術的記載。
[0130] 表1高山被孢霉野生型菌株與五株基因工程菌株脂肪酸產量比較
[0131]
[0132] 表2高山被孢霉野生型菌株與五株基因工程菌株脂肪組成比較
[0133]
[0135] 結果表明，通過本發明的方法獲得的過表達ω-3脫飽和酶基因（〇PpFADS17)的重 組高山被孢霉具有多次傳代的遺傳穩定性，且通過常溫培養獲得的產物中，其脂肪酸分析 結果與野生型菌株無明顯差別，所得菌株中EPA產量均有提高，其中菌株MA-〇PpFADS17-4中 EPA含量達到脂肪酸總量的31.5%，相比于野生型菌株EPA產量顯著提高，優于經過相同方 法得到的其他重組菌株，也顯著高于其他已知的過表達ω-3脫飽和酶基因的重組高山被孢 霉通過常溫培養工藝得到的ΕΡΑ產量。用此方法構建的基因工程菌株及構建方法為后續工 業化奠定了理論及應用基礎。
[0136] 雖然本發明專利已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明。任何熟悉 此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種改動與修飾。因此本發明的保護 范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一株過表達來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基因的重組高山被孢霉 (]\1〇1'1:丨6代11&&]^;[11&)]\^-〇?口?六0317-4，該菌株于2016年1月18日保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生 物研究所，保藏編號為CGMCC No. 11820。2. 根據權利要求1所述的重組高山被孢霉，其特征在于所述ω-3脫飽和酶〇PPFADS17基 因是根據高山被孢霉密碼子使用偏好性優化的，來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶基因，其 核酸序列如SEQ Ν0.1所示。3. 根據權利要求1所述的重組高山被孢霉，其特征在于該菌株是用含有ω-3脫飽和酶 oPpFADS17基因的重組質粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17轉化根瘤土壤桿菌后，再以含轉化質粒 pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的根瘤土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株構建而成 的。4. 根據權利要求3所述的重組高山被孢霉，其特征在于所述高山被孢霉尿嘧啶營養缺 陷型菌株是一株使高山被孢霉ATCC32222基因組中編碼乳清酸磷酸核糖轉移酶OPRTase的 ura5基因失活的高山被孢霉菌株。5. 構建權利要求1所述的重組高山被孢霉菌株的方法，包括以下步驟： a) 根據天然的來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶序列，根據高山被孢霉密碼子使用偏好 性優，人工合成化后的ω-3脫飽和酶基因 oPpFADSl7，如SEQ NO. 1所示； b) 構建重組質粒 pBIG2-ura5s-〇PpFADS17; c) 用構建獲得的重組質粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17轉化根瘤土壤桿菌； d) 用含重組質粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的根瘤土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養 缺陷型菌株； e) 篩選鑒定轉化菌株，獲得一株特別高產EPA的過表達ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基因的 重組高山被孢霉菌株MA-〇PpFADSl 7-4。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟c)的根瘤土壤桿菌為根瘤土壤桿 菌（Agrobacterium tumefaciens)C58Cl〇7. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟d)的高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷 型菌株是重組高山被孢霉MAU1，該菌株于2013年11月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.8414。8. 根據權利要求4所述的構建重組高山被孢霉菌株的方法，其特征在于所述步驟e)中 篩選鑒定轉化菌株的方法包括以下步驟： 1) 用3mL生理鹽水沖刷GY表面，收集液體于一個無菌1.5mL離心管中。過25μηι濾膜； 2) 用血球計數器計數，調整為三種孢子濃度梯度108個每100yL、106個每100yL、10 4個每 l〇〇yL，各取200yL涂布于含有100yg/mL壯觀霉素，100yg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板上，25°C 避光培養2-3d; 3) 隨時用無菌鑷子挑出生長的真菌菌絲于含有lOOyg/mL壯觀霉素，lOOyg/mL頭孢噻肟 的SC-CS平板上，25 °C培養2-3d; 4) 觀察高山被孢霉在平板上的生長情況，挑出在SC-CS平板上生長的菌絲接種于GY斜 面上； 5) 將上述步驟4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次； 6) 將穩定遺傳的菌株鑒定為過表達ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基因的重組高山被孢霉菌 株，保藏于GY斜面上； 7) 提取含有ω -3脫飽和酶oPpFADS 17基因的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA，設計一 對與啟動子和終止子特異性結合的引物進行PCR驗證： PI (sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT P2(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC； 8) 所述重組菌株保藏于GY斜面上。9. 權利要求1-4中任一項權利要求所述的重組高山被孢霉菌株MA-〇PpFADS17-4或根據 權利要求5-8中任一項權利要求所述的方法得到的重組高山被孢霉在生產脂肪酸中的用 途。10. 權利要求1-4中任一項權利要求所述的重組高山被孢霉菌株MA-〇PpFADS17-4或根 據權利要求5-9中任一項權利要求所述的方法得到的重組高山被孢霉在生產EPA方面的用 途。
【專利摘要】本發明提供了一株異源表達來源于寄生疫霉ω-3脫飽和酶基因的重組高山被孢霉菌株MA-oPpFADS17-4，并提供了構建所述重組高山被孢霉菌株的方法。本發明采用高山被孢尿嘧啶營養缺陷型菌株為材料，運用根瘤土壤桿菌介導的遺傳操作技術，得到一株常溫高產EPA的重組菌株，其EPA的產量達到1197.3mg/L，占總脂肪酸(TFA)含量的31.5％，對AA的轉化率達77.6％。本申請對產油真菌高山被孢霉的基礎理論研究及產品開發具有重要意義。CGMCC No. 1182020160118
【IPC分類】C12N15/80, C12R1/645, C12N1/15, C12P7/64
【公開號】CN105647822
【申請號】
【發明人】陳海琴, 陳永泉, 陳衛, 梅甜甜, 顧震南, 張灝
【申請人】江南大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月28日