麥芽三糖形成酶的高產菌株及其篩選和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物發酵的技術領域，具體說是一種麥芽三糖形成酶的高產菌株及其篩選和培養方法。
【背景技術】
[0002]麥芽三糖形成酶是一種具有形成麥芽三糖能力的淀粉酶制劑，可以從內部水解淀粉的α-l，4-糖苷鍵，從而生產麥芽三糖。
[0003]麥芽三糖是一種麥芽寡糖。麥芽三糖甜味柔和，甜度低，粘度高，滲透壓低，易消化吸收，抗結晶性能好，能明顯減少溶液冰點下降，促進人體對鈣的吸收，能有效抑制人體腸道內有害菌的生長，促進人體有益菌的繁殖，還可防止蛋白質變性，抑制淀粉老化，是一種理想的保健食品原料。麥芽三糖可以直達腸道，被小腸粘膜上的糖苷水解酶水解，迅速補充能量，可作為運動員、重體力勞動者及長途旅行者的最佳耐力型功能飲料。麥芽三糖也適合在風味乳飲料中應用，在乳飲料中加入6 %?8 %的麥芽三糖，可很大程度上提高乳飲料的營養和保健功能。麥芽三糖擁有卓越的吸濕性和保濕性能，在主食面包中添加5%以下的麥芽三糖，可改善面包色澤，使面包松軟、組織均勻，保濕性能良好，并能減緩面包老化，延長貨架期達到2?3d。麥芽三糖低甜度，較好的耐熱、耐酸性，可廣泛應用于糖果，冷凍食品，甜點心，糕點，口香糖，蛋糕，黃油，奶油，攪拌奶油，甜豆餡等。
[0004]目前麥芽三糖的生產方式分為兩類，一種是以普魯蘭多糖為原料，利用普魯蘭酶或異淀粉酶進行分解而獲得，用這一方法獲得的麥芽三糖純度高，是制備試劑和標樣的理想方法。但是普魯蘭價格昂貴，因而不適合用于食品原料的制備。另一種主要是通過麥芽三糖型淀粉酶分解淀粉而獲得。首先將淀粉用細菌α-淀粉酶進行液化后，再用麥芽三糖形成酶水解，使用這一水解工藝可以獲得較高麥芽三糖含量的糖漿。
[0005]麥芽三糖形成酶是制備麥芽三糖過程中不可獲取的酶，目前麥芽三糖形成酶在國內尚屬空白，并沒有生產廠家生產，技術被國外企業壟斷。而麥芽三糖形成酶的工業化生產主要是通過微生物發酵方法生產，但目前該活性酶的發酵水平還相當低。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種麥芽三糖形成酶的高產菌株及其篩選和培養方法O
[0007]本發明為解決公知技術中存在的技術問題所采取的技術方案是:
[0008]本發明的麥芽三糖形成酶的高產菌株，為蛾微桿菌Microbacterium imperiale的誘變菌株Metp-57，該菌株于2015年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.11536，保藏地址:北京朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所。
[0009]本發明還可以采用以下技術措施:
[0010]本發明的麥芽三糖形成酶的高產菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0011](I)選擇生長良好的產麥芽三糖生成酶的蛾微桿菌Mebl-012斜面菌株，制成18個/mL的菌懸液；
[0012](2)將(I)中的菌懸液，吸取1yL于圓形鐵片上，置于以氦氣為工作氣體，功率110W，工作氣流量10L/min的常壓室溫等離子體誘變系統中，處理距離為2mm，分別處理Os、10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s，將處理的孢子懸液進行梯度稀釋涂平板，制作致死率曲線；
[0013](3)根據(2)的致死率曲線，選擇高、中、低三個不同致死劑量的照射時間，對菌株Mebl-012的菌懸液進行等離子體誘變；
[0014](4)將(3)中三個不同處理時間的菌懸液混合于裝有生理鹽水的試管中，混合均勻；
[0015](5)將(4)中的誘變孢子懸液，進行梯度稀釋后，分別涂布于含有淀粉的篩選平板上；
[0016](6)將(5)中各個抗性平板上長出的單菌落轉接斜面后，以1%的接種量，接種于種子培養基中，30°C，150r/min，培養45-50h后，以10%的接種量將種子液接種于發酵培養基，30。(:，15(^/111丨11培養3-5(1;
[0017](7)取(6)中的發酵液于離心管中，7000r/min離心1min，取上清液為粗酶液，取Iml粗酶液加入到2 %可溶性淀粉溶液中，55°C水浴20分鐘，過有機濾膜后，利用高效液相色譜法測定麥芽三糖的產量，通過此方法篩選出麥芽三糖形成酶的高產菌株Metp-57。
[0018]蛾微桿菌Mebl-012購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.1.1910ο
[0019]種子培養基中:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，其余為蒸餾水，ρΗ7.0-7.2,121 °C高壓蒸汽滅菌20min;發酵培養基中:可溶性淀粉2 %，麩皮粉I %，蛋白胨0.8 %，磷酸氫二鉀0.5%,磷酸二氫鉀0.5%,硫酸鎂0.2%,硝酸鈉0.5%,吐溫40 0.1%,其余為蒸餾水，pH7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0020]本發明的麥芽三糖形成酶的高產菌株的培養方法，包括以下步驟:
[0021 ] (I)菌種活化:將蛾微桿菌Metp-57轉接至保藏分離培養基，30°C恒溫培養3_7d;
[0022](2)種子培養:選取生長良好的斜面，制備濃度約18個/mL的菌懸液，以1%的接種量接種于裝有10mL種子培養基的500mL三角瓶中，30°C，150r/min，震蕩培養45-50h;
[0023](3)發酵培養:將⑵中的種子培養液，以10 %的接種量接種于裝有I OOmL發酵培養基的500mL三角瓶中，30°C，150r/min，震蕩培養3-5d。
[0024]保藏分離培養基中:可溶性淀粉0.2%，蛋白胨I %，牛肉膏0.5 %，氯化鈉0.5 %，不足部分蒸餾水補足，PH7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min;種子培養基中:牛肉膏0.5%，蛋白胨I %，氯化鈉0.5%,其余為蒸餾水，pH7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min;發酵培養基中:可溶性淀粉2 %，麩皮粉I %，蛋白胨0.8 %，磷酸氫二鉀0.5%,磷酸二氫鉀0.5%,硫酸鎂0.2%,硝酸鈉0.5%,吐溫40 0.1%,其余為蒸餾水，pH7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0025]本發明具有的優點和積極效果是:
[0026]本發明的麥芽三糖形成酶的高產菌株及篩選、培養方法中，誘變菌株Metp-57是通過等離子體誘變方法獲得的，比常規誘變方法獲得的菌株遺傳穩定性更高，麥芽三糖形成酶的酶活更高，其產量相對于出發菌株Mebl-012的產量有較大提高，同時也降低了生產成本。
【具體實施方式】
[0027]以下通過實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
[0028]本發明的麥芽三糖形成酶的高產菌株，為蛾微桿菌Microbacterium imperiale的誘變菌株Metp-57，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.11536。
[0029]從土壤中篩選出的產麥芽三糖形成酶的菌株Mebl-012，蛾微桿菌Mebl-012購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.1.1910。。
[0030]Mebl-012菌體形態:菌體為革蘭氏陰性菌，菌體細胞呈桿狀。菌落呈橙黃色、隆起、邊緣光滑齊整，有粘性。
[0031 ] Mebl-012培養特征:此菌最適生長溫度為30°C，最適生長pH為7.0-7.2；在搖床轉速為140-15(^/11^11，培養2-3(1時，麥芽三糖形成酶產量最高，發酵過程中溫度對麥芽三糖形成酶的產生具有顯著影響。
[0032]誘變菌株Metp-57的特性:
[0033]菌體形態:菌體為革蘭氏陰性菌，菌體細胞呈桿狀。菌落呈橙黃色、隆起、邊緣光滑齊整，有粘性。
[0034]培養特征:此菌最適生長溫度為30°C，最適生長pH為7.1;在搖床轉速為150r/min，培養3d時，麥芽三糖形成酶酶活最高。
[0035]可以在含有淀粉的培養基中進行生長，向平板滴加碘液會在菌落周圍形成透明圈。
[0036]實施例1:
[0037]以蛾微桿菌Mebl-012為出發菌株，采用常壓室溫等離子體誘變技術篩選菌株Metp-57，包括以下步驟:
[0038](I)選擇生長良好的產麥芽三糖形成酶的蛾微桿菌Mebl-012斜面菌株，接種一環到種