一種海洋鏈霉菌及其次級代謝產物Streptochlorin的發酵制備工藝的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物發酵與天然產物提取分離技術領域，尤其是涉及一種海洋鏈霉 菌及其次級代謝產物streptochlorin的發酵制備工藝。
【背景技術】
[0002] Streptochlorin是一種吲噪類抗生素，Jae等人于2007年從海洋來源的鏈霉菌 04DH110中分離得到，并發現該化合物對人體細胞具有抗增值的活性(Jae，SH. ; Jeong， HS.; Lee, HS.; Park, SK.; Kim, HM.; Kwon, HJ. J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17, 1403)。在近幾年的研究中，該化合物被證實具有很好的抗腫瘤抗過敏活性(Lee，SH.; Shin, HJ.; Kim, DY.; Shim, Dff.; Kim, TJ.; Ye, SK.; Won, HS.; Koppula, S.; Kang, TB·; Lee, KH. PLoS One. 2013，8(9)，e74194)，抗炎活性（Shim, DW·; Shin, HJ.; Han, Jff.; Shin, WY.; Sun, X.; Shim, EJ.; Kim, TJ.; Kang, TB.; Lee, KH. Int. J. Mol. Sci. 2015. 16，6902)，抗菌活性（Zhang, MZ·; Chen, Q·; Xie, CH·; Mulhol land , N. ; Turner , S . ; Irwin , D . ; Gu , YC. ; Yang , GF . ; Clough , J . European Journal of Medicinal Chemistry. 2015, 92，776)等。
[0003] 國內外文獻對Streptochlorin的發酵鮮有報道，實驗中，我們利用一般的發酵條 件和制備條件，發現Streptochlorin的產量少，得率低，這成為該化合物進一步研究的限制 因素，不利于后期的工業開發。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一種海洋鏈霉菌及其次級代謝產物 Streptochlorin的發酵制備工藝，該方法可大幅提高次級代謝產物Streptochlorin產量， 快速、高效制備高純度的Streptochlorin。
[0005] 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種海洋鏈霉菌，該菌為 3￥丫1^]^-1-4菌株，分類命名為鏈霉菌（31:代口1:〇1115^6 8 8口.），于2015年9月30日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 11468。
[0006] 該菌株在平板培養初期呈現淡黃色半透明，菌落呈圓形，表面光滑濕潤，隨著培養 時間延長，氣生菌絲發育，覆蓋整個菌落表面，呈現白色。
[0007] -種海洋鏈霉菌次級代謝產物Streptochlorin的發酵制備工藝，包括以下步驟： (1) 固體培養 將保藏在_80°C冰箱中的保藏編號為CGMCC No. 11468的海洋鏈霉菌涂布于固體平板 培養基上，在27.5 °C培養箱中培養48 h得到平板菌種； (2) 種子培養 取生長良好的平板菌種，接種于裝液量為50%的液體培養基中，在27.5 °C，150 r/min 的條件下培養48 h得到種子液； (3) 發酵培養 取生長良好的種子液，按體積分數5%的接種量接種于裝液量為50%的液體培養基中，于 27.5 °C，150 r/min的條件下培養11 d得到發酵液； (4) 發酵液體處理 取發酵液加入等體積的乙酸乙酯充分萃取一次，收集萃取液，再取萃余液加入等體積 的乙酸乙酯重復萃取一次，再取萃余液加入等體積的乙酸乙酯萃取一次，合并三次萃取所 得萃取液，旋轉蒸發至干，再次用甲醇復溶，得到進樣液； (5) Streptochlorin的制備 采用高速逆流色譜(HSCCC)法對進樣液進行分離純化，得到海洋鏈霉菌次級代謝產物 StreptochlorinJp^。
[0008] 步驟（1)所述的固體平板培養基的配方如下：純水1 L、酵母提取物1.889 g、可溶 性淀粉8.636 g、K2HP〇4 0.359 g、MgS〇4 0.625 g、CaCl2 2.5 g、海水晶25 g、瓊脂15 g。
[0009] 步驟(2)和步驟(3)中所述的液體培養基配方如下:純水1 L、酵母提取物1.889 g、 可溶性淀粉8.636 g、K2HP〇4 0.359 g、MgS〇4 0.625 g、CaCl2 2.5 g、海水晶25 g。
[0010] 步驟(5)具體為： A. 取石油醚、乙酸乙酯、甲醇和純水按9:0.8:5:5的比例混合后作為高速逆流色譜儀的 兩相體系； B. 將兩相體系中以石油醚和乙酸乙酯為主的上相作為固定相，以甲醇和純水為主的下 相作為流動相，將固定相按50 mL/min的速度栗入高速逆流色譜儀直至儀器管路充滿固定 相，調節高速逆流色譜儀轉速，轉速達到800 r/min后，將流動相以5 mL/min的速度栗入高 速逆流色譜儀直至流動相和固定相達到平衡后進樣； C. 啟動檢測器開始監測，收集含Streptochlorin的出峰時間為42 min到52 min部分的 洗脫液，減壓濃縮后得到純度達90%及以上的海洋鏈霉菌次級代謝產物Streptochlorin單 體。
[0011] 與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明首次公開了一種海洋鏈霉菌及其次 級代謝產物Streptochlorin的發酵制備工藝，該發酵方法使Streptochlorin的產量大幅度 提高，達到3.37 mg/L。此外，制備Streptochlorin用到的HSCCC方法對比其他制備方法具有 進樣量大、流速快、純度高等特點，尤其能夠解決利用其他色譜方法制備時樣品回收率低的 問題。本發明對Str印tochlorin的科學研究和后期的工業開發都具有重大意義。
[0012] 上述海洋鏈霉菌，該菌為SYYLWHS-1-4菌株，分類命名為鏈霉菌（Streptomyces sp.)，保藏編號為CGMCC No. 11468,于2015年9月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
【附圖說明】
[0013] 圖1為Streptochlorin進樣液的超高效液相色譜(UPLC)圖； 圖2為經HSCCC純化后得到的Streptochlorin單體的超高效液相色譜(UPLC)圖； 圖3為Streptochlorin進樣液的HSCCC譜圖； 圖4為經HSCCC純化后得到的Streptochlorin單體的核磁鑒定Η譜； 圖5為經HSCCC純化后得到的Streptochlorin單體的核磁鑒定C譜； 圖6為經HSCCC純化后得到的Streptochlorin單體的MS譜圖。
【具體實施方式】
[0014] 以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0015] 具體實施例一 一種海洋鏈霉菌，該菌為SYYLWHS-1-4菌株，分類命名為鏈霉菌（Streptomyces sp.)， 保藏編號為CGMCC No. 11468，于2015年9月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心。該菌落在平板培養初期呈現淡黃色半透明，菌落呈圓形，表面光滑濕潤， 隨著培養時間延長，氣生菌絲發育，覆蓋整個菌落表面，呈現白色。該海洋鏈霉菌發酵生產 次級代謝產物Streptochlorin的具體步驟如下： (1) 固體培養 將保藏在_80°C冰箱中的保藏編號為CGMCC No. 11468的海洋鏈霉菌涂布于固體平板 培養基上，在27.5°C培養箱中培養48 h得到平板菌種;其中固體平板培養基的配方如下:純 水1 L、酵母提取物 1.889 g、可溶性淀粉8.636 g、K2HP〇4 0.359 g、MgS〇4 0.625 g、CaCl2 2.5 g、海水晶25 g、瓊脂15 g; (2) 種子培養 取生長良好的平板菌種，接種于裝液量為50%的液體培養基中，在27.5 °C，150 r/min 的條件下培養48 h得到種子液； (3) 發酵培養 取生長良好的種子液，按體積分數5%的接種量接種于裝液量為50%的液體培養基中，于 27.5 °C，150 r/min的條件下培養11 d得到發酵液;其中液體培養基配方如下:純水1 L、酵 母提取物 1.889 g、可溶性淀粉8.636 g、K2HP〇4 0.359 g、MgS〇4 0.625 g、CaCl2 2.5 g、海 水晶25 g; (4) 發酵液體處理 取發酵液加入等體積的乙酸乙酯充分萃取一次，收集萃取液，再取萃余液加入等體積 的乙酸乙酯重復萃取一次，再取萃余液加入等體積的乙酸乙酯萃取一次，合并三次萃取所 得萃取液，旋轉蒸發至干，再次用甲醇復溶，得到進樣液;HPLC檢測結果如圖1所示；說明 Streptochlorin是處理后發酵液中的主要成分，此外還有一些雜質； (5) Streptochlorin的制備 采用高速逆流色譜(HSCCC)法對進樣液進行分離純化，得到海洋鏈霉菌次級代謝產物 Streptochlorin單體，具體過程為： A. 取石油醚、乙酸乙酯、甲醇和純水按9:0.8:5:5的比例混合后作為高速逆流色譜儀的 兩相體系； B. 將兩相體系中以石油醚和乙酸乙酯為主的上相作為固定相，以甲醇和純水為主的下 相作為流動相，將固定相按50 mL/min的速度栗入高速逆流色譜儀直至儀器管路充滿固定 相，調節高速逆流色譜儀轉速，轉速達到800 r/min后，將流動相以5 mL/min的速度栗入高 速逆流色譜儀直至流動相和固定相達到平衡后進樣； C. 啟動檢測器開始監測，收集含Streptochlorin的出峰時間為42 min到52 min部分的 洗脫液，減壓濃縮后得到純度達90%及以上的海洋鏈霉菌次級代謝產物Streptochlorin單 體。
[0016] 將純化后得到的海洋鏈霉菌次級代謝產物Streptochlorin單體進行HPLC檢測，結 果如圖2所示，由圖2可知，經過HSCCC純化后得到是單一的Streptochlorin色譜峰。
[0017] Streptochlorin定性分析:對該鏈霉菌進行大量培養，乙酸乙酯萃取，用HSCCC分 離純化，得到單體化合物，進行核磁和質譜鑒定，結果如圖4、圖5、和圖6所示。
[0018] Streptochlorin化合物結構鑒定： (1) 分子量(MS)測定:化合物分子量在HPLC-MS色譜儀采用直接進樣測定，質譜條件:采 用電噴霧電離源離子源溫度100 °C，脫溶劑溫度250 °C，脫溶劑氮氣流速400 L/h，錐孔反 吹氮氣。四極桿掃描范圍m/z 50-500 J0F離子飛行方式采用V模式。使用亮腦啡肽作為外標 物對目標離子進行精確質量鎖定。采用正離子模式，毛細管電離電壓2.8 kV，取樣錐孔電壓 80 V，碰撞室能量5-80 V。得到的MS譜圖如圖6; (2) NMR 測定：樣品溶解于氖代甲醇，ΝΜ!?!!1!!，13C, homonuclear correlation spectroscopy(COSY), heteronuclear single quantum coherence spectroscopy (HSQC),和heteronuc