菌懸液進行梯度稀釋涂平板，制作致死率曲線；
[0082](3)根據(2)的致死率曲線，選擇20s、60s、80s三個不同致死劑量的照射時間，對菌株Meb 1-012的菌懸液進行等離子體誘變；
[0083](4)將(3)中三個不同處理時間的菌懸液混合于裝有生理鹽水的試管中，混合均勻；
[0084](5)將(4)中的誘變菌懸液，進行梯度稀釋10—llO—6，取10—4、10—5、10—6三個稀釋度的菌懸液，分別涂布于含有淀粉顯色平板上；
[0085](6)將(5)中各個平板上淀粉透明圈大的單菌落轉接斜面后，以1%的接種量，接種于種子培養基中，30 °C，150r/min，培養48h后，以10%的接種量將種子液接種于發酵培養基，30°C，150r/min培養2.5d；種子培養基組成為:牛肉膏0.5%，蛋白胨I %，氯化鈉0.5%,其余為蒸餾水，pH7.1，121°C高壓蒸汽滅菌20min;所述發酵培養基組成為:可溶性淀粉2 %，麩皮粉I %，蛋白胨0.8 %，磷酸氫二鉀0.5 %，磷酸二氫鉀0.5%,硫酸鎂0.2%,硝酸鈉0.5%，吐溫40 0.1%，其余為蒸饋水，pH7.1，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0086](7)取(6)中的發酵液于離心管中，7000r/min離心1min，取離心上清液Iml，加入裝有1ml 2%可溶性淀粉的大號試管中，于50°C的水浴搖床上水浴20min，取酶解液過有機濾膜后，利用高效液相色譜法測定麥芽三糖的產量，通過此方法即篩選出麥芽三糖形成酶酶活高的誘變菌株Metp-57。
[0087]本發明的麥芽三糖形成酶的高產菌株的培養方法，包括以下步驟:
[0088]1、培養基的配制
[0089](I)保藏分離培養基:牛肉膏0.5 %，蛋白胨I %，氯化鈉0.5%,其余為蒸餾水，pH7.1，121°C高壓蒸汽滅菌20min;
[0090](2)種子培養基:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%,其余為蒸餾水，pH7.1，121<€高壓蒸汽滅菌20111；[11;
[0091 ] (3)發酵培養基:可溶性淀粉2%，麩皮粉I %，蛋白胨0.8%，磷酸氫二鉀0.5%，磷酸二氫鉀0.5%,硫酸鎂0.2%,硝酸鈉0.5%,吐溫40 0.1%,其余為蒸餾水，pH7.1，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0092]2、菌種活化
[0093]將甘油保存的菌種Metp-57轉接至保藏分離培養基斜面，于恒溫培養箱中，30°C培養 1d;
[0094]3、種子培養
[0095]選擇生長良好的活化斜面，接種于裝有上述I中制得的種子培養基中，500mL三角瓶內裝10mL培養基，于30 °C，150r/min，培養48h ；
[0096]4、發酵培養
[0097]將上述步驟3中制得的種子液以10%(v/v)接種量接種于發酵培養基中，500mL三角瓶內裝80mL培養基，于30°C，150r/min條件下發酵培養4d。
[0098]檢測結果:蛾微桿菌Microbacterium imperiale Metp-57在發酵培養基上麥芽三糖生成酶的產量為243.92U/mL，比出發菌株Mebl-012的產量116.43U/mL，提高了 109.5%。
[0099]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制，雖然本發明已以較佳實施例公開如上，然而，并非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍內，當然會利用揭示的技術內容作出些許更動或修飾，成為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發明技術方案的范圍內。
【主權項】
1.一種麥芽三糖形成酶的高產菌株，為蛾微桿菌Microbacterium imperiale的誘變菌株Metp-57，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.11536。2.—種麥芽三糖形成酶的高產菌株的篩選方法，包括以下步驟: (1)選擇生長良好的產麥芽三糖生成酶的蛾微桿菌Mebl-012斜面菌株，制成1MVmL的菌懸液； (2)將(I)中的菌懸液，吸取1yL于圓形鐵片上，置于以氦氣為工作氣體，功率110W，工作氣流量10L/min的常壓室溫等離子體誘變系統中，處理距離為2mm，分別處理Os、1s、20s、.308、408、508、608、708、808、908，將處理后的孢子懸液進行梯度稀釋涂平板，制作致死率曲線； (3)根據(2)的致死率曲線，選擇高、中、低三個不同致死劑量的照射時間，對菌株Mebl-.012的菌懸液進行等離子體誘變； (4)將(3)中三個不同處理時間的菌懸液混合于裝有生理鹽水的試管中，混合均勻； (5)將(4)中的誘變孢子懸液，進行梯度稀釋后，分別涂布于含有淀粉的篩選平板上； (6)將(5)中各個抗性平板上長出的單菌落轉接斜面后，以1%的接種量，接種于種子培養基中，30 °C，150r/min，培養45-50h后，以10%的接種量將種子液接種于發酵培養基，30°C，.150r/min 培養3_5d; (7)取(6)中的發酵液于離心管中，7000r/min離心1min，取上清液為粗酶液，取Iml粗酶液加入到2%可溶性淀粉溶液中，55°C水浴20分鐘，過有機濾膜后，利用高效液相色譜法測定麥芽三糖的產量，通過此方法篩選出麥芽三糖形成酶的高產菌株Metp-57。3.根據權利要求2所述的麥芽三糖形成酶的高產菌株，其特征在于:蛾微桿菌Mebl-012購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號CGMCCN0.1.1910。4.根據權利要求3所述的麥芽三糖形成酶的高產菌株的篩選方法，其特征在于:種子培養基中:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，其余為蒸餾水，？!17.0-7.2，121°(:高壓蒸汽滅菌20min;發酵培養基中:可溶性淀粉2%，麩皮粉1%，蛋白胨0.8%，磷酸氫二鉀0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.2%，硝酸鈉0.5%，吐溫40 0.1%，其余為蒸餾水，pH7.0_7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min。5.—種麥芽三糖形成酶的高產菌株的培養方法，包括以下步驟: (1)菌種活化:將蛾微桿菌Metp-57轉接至保藏分離培養基，30V恒溫培養3_7d; (2)種子培養:選取生長良好的斜面，制備濃度約18個/mL的菌懸液，以1%的接種量接種于裝有10mL種子培養基的500mL三角瓶中，30°C，150r/min，震蕩培養45-50h; (3)發酵培養:將(2)中的種子培養液，以體積比10%的接種量接種于裝有10mL發酵培養基的500mL三角瓶中，30°C，150r/min，震蕩培養3_5d。6.根據權利要求5所述的麥芽三糖形成酶的高產菌株的培養方法，其特征在于:保藏分離培養基中:可溶性淀粉0.2%，蛋白胨I %，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，其余為蒸餾水，pH7.0-.7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min;種子培養基中:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，不足部分蒸餾水補足，PH7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min ;發酵培養基中:可溶性淀粉.2%，麩皮粉1%，蛋白胨0.8%，磷酸氫二鉀0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.2%，硝酸鈉0.5%，吐溫40 0.1%，其余為蒸餾水，pH7.0-7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
【專利摘要】一種麥芽三糖形成酶的高產菌株及篩選、培養方法中，高產菌株為蛾微桿菌Microbacterium？imperiale的誘變菌株Metp-57，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC11536。誘變菌株Metp-57是通過等離子體誘變方法獲得的，比常規誘變方法獲得的菌株遺傳穩定性更高，麥芽三糖形成酶的酶活更高，其產量相對于出發菌株Mebl-012的產量有較大提高，同時也降低了生產成本。CGMCC1153620151028
【IPC分類】C12R1/01, C12N1/20, C12N15/01, C12N13/00
【公開號】CN105647827
【申請號】
【發明人】喬長晟, 朱明 , 李文軍, 郭鵬, 劉艷麗
【申請人】天津北洋百川生物技術有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月9日