一種解淀粉芽孢桿菌及其在防治甘蔗赤腐病中的運用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物和發酵技術領域，尤其來說是一種解淀粉芽孢桿菌及其在防治 甘蔗赤腐病中的運用。
【背景技術】
[0002] 甘蔗是最重要的糖料作物，蔗糖占世界食糖總產量70%以上，占我國食糖總產 90%以上。甘蔗還因其具有高生物量和高纖維等特點而成為最重要的可再生能源作物之 一。甘蔗病害是影響甘蔗產量及糖分的重要因素之一。由鐮型炭疽菌 Colletotrichumfalcatum Went引起的甘鹿赤腐病是世界甘鹿生產過程中重要的病害之 一。該病害不僅對產量造成影響，而且其病原菌還能促使蔗糖轉化，從而降低蔗汁純度和減 少蔗糖糖分。
[0003] 甘蔗赤腐病傳統防治主要依靠化學藥劑，目前對甘蔗赤腐病尚無高效的化學農 藥，導致濫用高毒劇毒農藥現象仍然存在。隨著社會經濟的發展和生活水平的提高，人們的 食品安全意識日益增強，對甘蔗中有無農藥殘留及其它有害物質的污染等問題日益關注。 利用拮抗微生物防治甘蔗病害有望成為代替化學藥劑的一種安全、無毒及有效的新方法。 拮抗微生物不僅可以防病，而且還能促進植物生長，對改善林地生態系統，保持林間生物多 樣性，以及維護林田生態平衡實現林業可持續發展將起到重要作用。全球生物農藥的產量 以每年10%-20%的速度遞增。目前，全世界生物農藥產品已經超過100多種，其中90%是微 生物殺蟲劑，微生物殺菌劑相對較少。尤其是利用解淀粉芽抱桿菌防治甘蔗赤腐病還未見 報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是針對上述技術存在甘蔗赤腐病防治上的缺陷，提供解淀粉芽孢桿 菌及其在防治甘蔗赤腐病中的運用。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:一種解淀粉芽孢桿菌TWC2,于2015年 10月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC Νο·11515〇
[0006] 本發明提供一株解淀粉芽孢桿菌TWC2在防治甘蔗赤腐病中的運用，利用該菌株制 備防治甘蔗赤腐病的生物制劑施用于甘蔗。
[0007] 本發明提供一株解淀粉芽孢桿菌TWC2發酵液的培養方法，將TWC2菌株接種于LB培 養基平板，37 °C恒溫培養24h，得到活化的TWC2菌株單菌落，然后挑取單菌落接種于LB培養 基中，37 °C、200rpm/min條件下振蕩培養16h獲得TWC2種子液，按7 %的接種量將解淀粉芽孢 桿菌TWC2種子液接入LB培養基中，34°C，200rpm/min，搖床培養48h獲得解淀粉芽孢桿菌 TWC2發酵液。
[0008] 進一步的，培養pH為5.0~9.0。
[0009] 進一步的，培養pH為6.0。
[0010] 進一步的，所述培養基組成為:麥芽糖5g/L、果糖10g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸出 1(^凡、氯化|丐]^/1。
[0011] 本發明的有益技術效果是:本發明解淀粉芽孢桿菌TWC2分離自熱帶牧草臺灣草葉 片，為甘蔗赤腐病的防治提供了一條環保、簡單、有效的途徑；本發明的解淀粉芽孢桿菌 TWC2是一株具良好生防應用前景的菌株，因為該菌株是從植株表面分離獲得，與自然生態 具有天然的和諧相融性，與化學農藥相比，對土壤生態無毒副作用、無殘留，因此，在病害的 生物防治實踐中具有潛在的商業開發和應用價值。
【附圖說明】
[0012] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可 以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0013]圖1:解淀粉芽孢桿菌TWC2和甘蔗赤腐病菌的對峙培養實驗結果(其中，左圖為甘 蔗赤腐病菌菌株SL121與TWC2的對峙結果，右圖為甘蔗赤腐病菌菌株SL120與TWC2的對峙 結果）；
[0014] 圖2:解淀粉芽孢桿菌TWC2在LB平板上的形態圖（左圖為TWC2在LB平板的菌落生長 正面，右圖為TWC2在LB平板的菌落生長背面）；
[0015] 圖3:解淀粉芽孢桿菌TWC2生長曲線圖；
[0016] 圖4:解淀粉芽孢桿菌TWC2致死溫度的測定(其中，左圖分別為50 °C、60 °C、70 °C、80 °C、90°C、99°C處理后平板上TWC2菌落生長情況，右圖中分別為90~98°C處理后TWC2的菌落 生長情況）；
[0017] 圖5:解淀粉芽孢桿菌TWC2抗生素抗性圖（從左至右依次為對照、頭孢霉素、紅霉 素、鏈霉素、氨芐青霉素、利福平、卡那霉素、四環素、氯霉素）；
[0018] 圖6:解淀粉芽孢桿菌TWC2與熱帶作物常見病原真菌的拮抗效果圖（其中，1~5分 別代表西瓜枯萎病菌，甘蔗赤腐病菌，芒果炭疽病菌，橡膠樹炭疽病菌、王草莖點霉葉斑病 與TWC2對峙培養）；
[0019] 圖7:解淀粉芽孢桿菌TWC2對甘蔗赤腐病離體葉片的防治效果圖（CK為清水對照； 處理1:先噴施TWC2，后接種病原菌；處理2:先接種病原菌，后噴施TWC2;處理3 :僅接病原 菌)。
【具體實施方式】
[0020] 下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于 本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0021] 1.TWC2 的篩選
[0022] TWC2菌株是從我國海南省儋州市牧草種資資源圃的臺灣草植株葉片上分離到的， 具體方法:在無菌超凈工作臺上分別剪取直徑約為5mm X 5mm大小的葉片組織，用75 %酒精 和0.1 %的升汞進行表面消毒30s，無菌水清洗3次后，移植到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養基 上，在28°C培養箱中培養，挑取菌落形態不同的菌株，進一步劃線純化保存備用。
[0023]按5點接菌法將2株強致病力的甘蔗赤腐病菌病接入TOA培養基平板中央，生防菌 接于病原菌四周，篩選抑菌作用最強的菌株，結果獲得一株對甘蔗赤腐病具有抑制作用的 菌株，且其防效達到70%以上，將該菌株命名為TWC2,拮抗作用結果見圖1所示。
[0024] 2.TWC2菌株的鑒定
[0025] (1)形態學觀察與鑒定:將TWC2菌株在LB培養基上于28 °C下培養2d，觀察其菌落形 態(形狀、顏色光澤、表面是否隆起或凹陷、邊緣形狀等）；
[0026] (2)生理生化反應觀察:將TWC2菌株接種于耐鹽性、梓檬酸鹽利用、明膠液化、淀粉 水解、接觸酶、甲基紅、V_P、纖維素水解、吲哚實驗等測試培養基中，觀察反應情況；
[0027] (3)分子生物學鑒定：提取菌株的基因組0以，以細菌通用引物27?:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，以TWC2菌株的基因組 DNA為模板，PCR擴增后經電泳檢測，測序，序列如SEQ NO: 1所示。
[0028]采用常規生理生化及16sDNA序列分析對TWC2菌株進行鑒定，確定該菌株為解淀粉 芽孢桿菌。該菌株的基本生物學特性見表1。
[0029] 表1. TWC2菌株的基本生物學特性
[0030] '[0031]~"+"呈陽性反應，或可以生長、利用；
呈陰性反應，或不可以生長、利用。 '
[0032]菌株在LB培養基上呈白色，近圓形，表面濕潤，有褶皺，不透明（見圖片2)。顯微鏡 下觀察，菌株菌體桿狀，產芽孢，革蘭氏反應為陽性。菌株TWC2部分生理生化指標的測定依 據《常見細菌系統鑒定手冊》，TWC2菌株生理生化特征均與解淀粉芽孢桿菌相同。因此將其 命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TWC2，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus &11171〇1丨9116€3(^6118)1￥02，已于2015年10月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心（簡稱:CGMCC，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研 究所，郵政編碼 100101，電話:010-64807355)。保藏號:CGMCC No. 11515。
[0033] 以解淀粉芽孢桿菌TWC2的基因組DNA為模板，以細菌16s rDNA序列通用引物作為 引物，PCR擴增出的1.5kb的產物片段。測序結果表明序列長度為1511bp(見序列表：）將測定 的序列用Blast軟件與GenBank中的已知的16s rDNA進行同源性比較，通過比對發現與 Bacillus amyloliquefaciens(登錄號：JN382250、CP007165和CP010556)同源性為99%。
[0034] 3.解淀粉芽孢桿菌TWC2種子液制備及最佳接種時間確定
[0035]將TWC2菌株接種于LB培養基平板，37°C恒溫培養24h，得到活化的TWC2菌株單菌 落，然后挑取單菌落接種于LB培養基中，37°C、200rpm/min條件下振蕩培養16h即得TWC2種 子液。
[0036]按1 %的接種量將解淀粉芽孢桿菌T W C 2種子液接入L B液體培養基中，3 7 °C、 200rpm/min搖床培養，每隔lh取樣測定0D6qq，連續測定36h，繪制生長曲線圖以確定種子液 的最佳接種時間。
[0037] 每隔lh取TWC2培養液，用分光光度計測定其OD600,連續測定36h得出了一系列的0D 數值，將這些數值做成細菌生長曲線圖（如圖3)。在0~24h處于對數生長期，菌體生長力旺 盛，菌體濃度迅速增大，這個時期TWC2以幾何級數極快增長，24h時OD600最大值為2.335; 24 ~361^102進入穩定期，生長菌群總數處于平坦階段，006〇()值在2.100~2.400之間波動。考 慮到菌體濃度和發酵成本，選取培養24h的TWC2菌液作為最佳接種時間的種子液。
[0038] 4.解淀粉芽孢桿菌TWC2最適培養條件
[0039] 4.1菌株生長最適培養基
[0040] 將TWC2種子液接入LB液體培養基中，200rpm/min振蕩培養24h，按照1 %的接種量 分別接入以下幾種培養基中：NA培養基(葡糖糖10g，蛋白胨5g，酵母粉lg，牛肉膏3g，蒸餾 水1000mL)，基礎發酵培養基（葡糖糖10g，蛋白胨10g，KH2P〇4〇 · 2g，MgS〇4〇 · 2g，蒸餾水 lOOOmL)，LB培養基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉 10g，蒸餾水lOOOmL)，YSP培養基(酵母浸 膏5g，鹿糖20g，蛋白胨10g，蒸餾水lOOO