lear multiple bond correlation spectroscopy (HMBC)]用 Varian IN0VA 400色譜儀測定，測定咕在400 MHz條件下操作，測定13C在100 MHz條件下 操作，tetramethylsilane (TMS)作為內標。得到的NMR咕和13C譜圖如圖4、圖5。 [0019]該化合物為淡黃色晶體，冊131-]\^111/2 :219.0303 []\1+!1] +，計算值為218.0303。 該化合物的1Η和13C NMR數據：? NMR (500 MHz, CD30D, TMS) ppm:7.28 (2H, dt, J = 24.0), 7.45 (1H, d, J = 8.1),7.81 (1H, d, J = 2.7),7.88 (1H, s),8.09 (1H, d, J = 7.9)，8·65 (1H, s);13C NMR (126 MHz, CD30D, TMS) ppm: 103.93, 111 .61，120.93， 121.32,121.83,123.43,123.46,124.56,135.80,143.34,147.72。
[0020] 實驗結果分析：經HPLC-MS和NMR測定，化合物Streptochlorin的分子為 C11H7CIN2O，化合物Streptochlorin的分子量為，化學結構圖如下所示
[0021] Streptochlorin定量分析:waters C18反相色譜柱（1 · 7 μπι，2 · 1 X 100 mm)，進樣 體積1 yL，流速5 mL/min，梯度洗脫，10 min內，由10%甲醇和90%水到90%甲醇和10%水， Streptochlorin5.7 min左右出峰，220 nm波長下對色譜圖進行積分，根據其色譜峰面積及 測定的Streptochlorin的標準曲線進行定量分析，計算得到海洋鏈霉菌次級代謝產物 Streptochlorin單體純度可達90%，每升發酵液可產Streptochlorin3·37 mg。
[0022] 具體實施例二 1、培養條件顯著影響因素的確定 對培養基的酵母粉(Χι)，可溶性淀粉(X2)，MgS〇4(X3)，K2HP〇4(X4)，CaCl 2(X5)，初始pH 值(X6)，medium volume(X7)，temperature(X8)，marinum salt(Xg)九個因素進行變量分析。 每個變量均設定一高( + 1)-低(-1)2個水平(具體數值見表1)。用Minitab軟件生成12因素 20次的Plackett-Burman實驗(其中Χι〇、Χιι和Xi2為虛擬變量），以Streptochlorin產量(mg/ L)作為響應值(Y)，通過Mintab軟件分析各因素的效應值，選擇影響效應比較高的因素做進 一步考察。實驗設計見表1及結果見表2，分析結果見表3。 [0023]表1培養基配方中各變量的水平
[0024]表 2 12 因素 20 次的 Plackeet-Burman 實驗
[0025]表3分析結果
由表3可知，對51:^。1:〇(3111〇1'；[11產量影響較大（？<0.05)是酵母粉(乂1)，可溶性淀粉 (Χ2)和 K2HP04(X4)。
[0026] 2、最優培養基的確定 根據Box-Behnken的中心組合設計原理，對由上述具體實施例二實驗結果所確定的3因 子各取3個水平，進行了 20個試驗點的響應面分析，對顯著影響因素進行進一步的優化，對 于其他非主要因素，均取平均水平值(具體數值見表4)。以Streptochlorin的產量(mg/L)作 為響應值(Z)，通過Mintab對實驗數據進行分析。實驗設計見表4及結果見表5,分析結果見 表6〇
[0027]表4培養基配方中各變量的水平
[0028] 表5 Box-Behnken的中心組合實驗設計及結果
[0029] 表6分析結果
根據實驗分析結果結果得到的各因素效應系數，建立海洋鏈霉菌代謝產物 Streptochlorin的產量對三個顯著影響因素的多元二次方程，如下所示： Z=2.9040+0.7703*Xi+0.5307*X2+0.4665*X4-〇. 4688*Χι2-〇 . 5895*X22-〇 . 19 9 4*X42+ 0 · 1315*Xi*X2_0 · 2668*Xi*X4_0 · 2163*X2*X4 對所得的回歸方程分別求三個變量的一階偏導數，并令其為〇，得到三元一次方程組， 求解得Xi、X2和X4，換算得Streptochlorin產量取得最大值時的最佳培養條件:酵母粉1.889 g/L，可溶性淀粉 8.636 g/L，K2HP〇4 0.359 g/L。其他條件取中間值:MgS〇4 0.625 g/L， CaCl2 2.5 g/L，海水精25 g/L，裝液量50%，初始pH值7.0,培養溫度27.5 °C。此時代 謝產物Streptochlorin的產量為3.4179 mg/L，。為確定所建立的實驗模型與實際結果的相 符性，在優化的發酵條件下重復實驗3次，得到Streptochlorin的平均產量為3.37 mg/L，實 驗值與理論值相比僅相差1.4%，說明該模型比較可靠。
[0030] 3、最優培養時間的確定 選擇優化的培養基配方，將海洋鏈霉菌的種子液接入該培養基（1 L錐形瓶，裝液量為 40%，5%接種量）中，在25 °C，150 rpm的條件下培養15 d。每天取樣10 mL乙酸乙酯萃取，以 Streptochlorin在220 nm下的色譜峰面積為響應值，發現第11天產生的Streptochlorin最 多。
[0031]表7培養天數優化實驗
[0032] 綜上所述，用Plackett-Burman實驗設計和Box-Behnken響應面分析法對影響該鏈 霉菌產Streptochlorin的發酵條件進行優化，結合核磁共振和質譜對Streptochlorin進行 定性分析，利用超高效液相色譜對Strep toch lor in進行定量分析，最終得到此菌株產 Streptochlorin的最佳發酵條件為:純水1 L、酵母提取物1.889 g、可溶性淀粉8.636 g、 K2HP〇4 0.359 g、MgS〇4 0.625 g、CaCl2 2.5 g、海水晶25 g、培養時間 11 d，在優化條件培 養下，產生的Streptochlorin含量達到3·37 mg/L。制備Streptochlorin用到的HSCCC方法 對比其他制備方法具有進樣量大、流速快、純度高等特點，尤其能夠解決利用其他色譜方法 制備時樣品回收率低的問題。本次優化大大提高了 Streptochlorin的產量，為該菌的后期 工業化開發打下了良好基礎。
[0033] 當然，上述說明并非對本發明的限制，本發明也并不限于上述舉例。本技術領域的 普通技術人員在本發明的實質范圍內作出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發明的保 護范圍，本發明的保護范圍以權利要求書為準。
【主權項】
1. 一種海洋鏈霉菌，其特征在于：該菌為SYYLWHS-1-4菌株，分類命名為鏈霉菌 (51:代口1:〇1115^68 8口.），于2015年9月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，保藏編號為CGMCC No. 11468。2. 根據權利要求1所述的一種海洋鏈霉菌，其特征在于:該菌株在平板培養初期呈現淡 黃色半透明，菌落呈圓形，表面光滑濕潤，隨著培養時間延長，氣生菌絲發育，覆蓋整個菌落 表面，呈現白色。3. -種海洋鏈霉菌次級代謝產物Streptochlorin的發酵制備工藝，其特征在于包括以 下步驟： (1) 固體培養 將保藏在_80°C冰箱中的保藏編號為CGMCC No. 11468的海洋鏈霉菌涂布于固體平板 培養基上，在27.5 °C培養箱中培養48 h得到平板菌種； (2) 種子培養 取生長良好的平板菌種，接種于裝液量為50%的液體培養基中，在27.5 °C，150 r/min 的條件下培養48 h得到種子液； (3) 發酵培養 取生長良好的種子液，按體積分數5%的接種量接種于裝液量為50%的液體培養基中，于 27.5 °C，150 r/min的條件下培養11 d得到發酵液； (4) 發酵液體處理 取發酵液加入等體積的乙酸乙酯充分萃取一次，收集萃取液，再取萃余液加入等體積 的乙酸乙酯重復萃取一次，再取萃余液加入等體積的乙酸乙酯萃取一次，合并三次萃取所 得萃取液，旋轉蒸發至干，再次用甲醇復溶，得到進樣液； (5) Streptochlorin的制備 采用高速逆流色譜(HSCCC)法對進樣液進行分離純化，得到海洋鏈霉菌次級代謝產物 StreptochlorinJp^。4. 根據權利要求3所述的一種海洋鏈霉菌次級代謝產物Streptochlorin的發酵制備工 藝，其特征在于步驟(1)所述的固體平板培養基的配方如下:純水1 L、酵母提取物1.889 g、 可溶性淀粉8.636 g、K2HP〇4 0.359 g、MgS〇4 0.625 g、CaCl2 2.5 g、海水晶25 g、瓊脂 15 g°5. 根據權利要求3所述的一種海洋鏈霉菌次級代謝產物Streptochlorin的發酵制備工 藝，其特征在于步驟（2)和步驟（3)中所述的液體培養基配方如下：純水1 L、酵母提取物 1.889 g、可溶性淀粉8.636 g、K2HP〇4 0.359 g、MgS〇4 0.625 g、CaCl2 2.5 g、海水晶25 g。6. 根據權利要求3所述的一種海洋鏈霉菌次級代謝產物Streptochlorin的發酵制備工 藝，其特征在于步驟(5)具體為： A. 取石油醚、乙酸乙酯、甲醇和純水按9:0.8:5:5的比例混合后作為高速逆流色譜儀的 兩相體系； B. 將兩相體系中以石油醚和乙酸乙酯為主的上相作為固定相，以甲醇和純水為主的下 相作為流動相，將固定相按50 mL/min的速度栗入高速逆流色譜儀直至儀器管路充滿固定 相，調節高速逆流色譜儀轉速，轉速達到800 r/min后，將流動相以5 mL/min的速度栗入高 速逆流色譜儀直至流動相和固定相達到平衡后進樣； C.啟動檢測器開始監測，收集含Streptochlorin的出峰時間為42 min到52 min部分的 洗脫液，減壓濃縮后得到純度達90%及以上的海洋鏈霉菌次級代謝產物Streptochlorin單 體。
【專利摘要】本發明公開了一種海洋鏈霉菌及其次級代謝產物Streptochlorin的發酵制備工藝，特點是該菌保藏編號為CGMCC？No.？11468，發酵工藝具體包括將海洋鏈霉菌接種在PDA上在27.5？℃培養箱中培養2？d的步驟；挑取單菌落再接種到種子培養基上于27.5？℃培養2？d的步驟；將種子液按體積分數5%的接種量接種到發酵培養基中，于27.5？℃，150？r/min的條件下培養11？d的步驟；代謝產物萃取的步驟；最后采用高速逆流色譜法對進樣液進行分離純化得到產物的步驟，優點是制備速度快，產物純度高以及產量大。CGMCC No. 1146820150930
【IPC分類】C12R1/465, C12P17/18, C12N1/20
【公開號】CN105647828
【申請號】
【發明人】何山, 嚴小軍, 勵林
【申請人】寧波大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月16日