清采用劑量為45KGy的γ 射線照射;然后將上述血清裝入連續流血漿滅菌器內并以50°角度采用紫外線照射，其中連 續流血漿滅菌器的流速為270mL/min，照射同時將血清通過ΕΚ級無石棉蔡氏濾片得到濾液， 將該濾液通過〇.25μπι過濾膜過濾后，再經過150nm過濾膜過濾，得到鹿血清樣品2。將上述制 備所得的鹿血清保存在-20 °C的冰箱中冷凍保存。
[0037] 具體實施例三
[0038] (1)采血：將上述選擇好的待采血鹿依次采用濃度為2wt. %的碘酒和濃度為 75vol. %的酒精對鹿體進行全身清潔消毒處理，處理結束后，使用無菌采血針從清潔消毒 后鹿體的靜脈進行全血采集，并將采集到的全血存放在離心瓶中并于4°C下靜置5h;
[0039] (2)分離：將經（1)處理后的鹿全血在4°C的條件下，采用2500rpm的轉速離心 45min，離心結束后在真空環境下從離心瓶中抽取血清，將該抽取所得的血清置于-25°C下 保存備用，得到冷凍的血清；
[0040] (3)去除纖維蛋白：將經(2)處理所得的冷凍血清置于4°C的冰箱中進行融化，將融 化后所得血清通過八層無菌紗布過濾去除纖維蛋白，收集濾液；
[0041] (4)滅活:將經(3)處理所得濾液置于56°C下嚴格控制水溫條件下恒溫水浴35min， 水浴過程中隨時晃動濾液保持其濾液均勻，避免濾液產生沉淀；
[0042] (5)降低IgG濃度和葡萄糖含量:將經(4)處理后的濾液采用目前常規使用的層析 法將IgG濃度降低至小于5μg/ml;然后采用能夠透析蛋白分子量為13000的透析膜在于 0.17mol/L的NaCl水溶液中透析至葡萄糖含量小于0.5mg/ml;
[0043] (6)去除病毒和支原體及除菌過濾:將經(5)處理后的血清采用劑量為40KGy的γ 射線照射;然后將上述血清裝入連續流血漿滅菌器內并以48°角度采用紫外線照射，其中連 續流血漿滅菌器的流速為260mL/min，照射同時將血清通過ΕΚ級無石棉蔡氏濾片得到濾液， 將該濾液通過〇.22μπι過濾膜過濾后，再經過120nm過濾膜過濾，得到鹿血清樣品3。將上述制 備所得的鹿血清保存在-20 °C的冰箱中冷凍保存。
[0044] 具體實施例四
[0045] (1)采血：將上述選擇好的待采血鹿依次采用濃度為2wt. %的碘酒和濃度為 75vol. %的酒精對鹿體進行全身清潔消毒處理，處理結束后，使用無菌采血針從清潔消毒 后鹿體的靜脈進行全血采集，并將采集到的全血存放在離心瓶中并于4°C下靜置6h;
[0046] (2)分離：將經（1)處理后的鹿全血在4°C的條件下，采用2000rpm的轉速離心 45min，離心結束后在真空環境下從離心瓶中抽取血清，將該抽取所得的血清置于-28°C下 保存備用，得到冷凍的血清；
[0047] (3)去除纖維蛋白：將經(2)處理所得的冷凍血清置于5°C的冰箱中進行融化，將融 化后所得血清通過八層無菌紗布過濾去除纖維蛋白，收集濾液；
[0048] (4)滅活:將經(3)處理所得濾液置于56°C下嚴格控制水溫條件下恒溫水浴30min， 水浴過程中隨時晃動濾液保持其濾液均勻，避免濾液產生沉淀；
[0049] (5)降低IgG濃度和葡萄糖含量:將經(4)處理后的濾液采用目前常規使用的層析 法將IgG濃度降低至小于5μg/ml;然后采用能夠透析蛋白分子量為13000的透析膜在于 0.16mol/L的NaCl水溶液中透析至葡萄糖含量小于0.5mg/ml;
[0050] (6)去除病毒和支原體及除菌過濾:將經(5)處理后的血清采用劑量為40KGy的γ 射線照射;然后將上述血清裝入連續流血漿滅菌器內并以45°角度采用紫外線照射，其中連 續流血漿滅菌器的流速為270mL/min，照射同時將血清通過ΕΚ級無石棉蔡氏濾片得到濾液， 將該濾液通過〇.22μπι過濾膜過濾后，再經過150nm過濾膜過濾，得到鹿血清樣品4。將上述制 備所得的鹿血清保存在-20 °C的冰箱中冷凍保存。
[0051] 對上述收集到的鹿血清樣品1至樣品4做滲透壓檢測、pH值檢測、蛋白質含量檢測、 細菌及真菌檢測、支原體及病毒檢測，所采用的檢測方法采用本領域技術人員使用的常規 檢測方法進行檢測，檢測結果參見表1所述。
[0052] 表 1
[0053]
[0054]上述具體實施例1至具體實施例4中制備所得的鹿血清可以應用于含血清細胞培 養基的配制中。
【主權項】
1. 一種鹿血清的分離制備方法，其特征在于:包括下述步驟： (1) 采血:將待采血鹿采用消毒液進行鹿體全身清潔消毒處理后，無菌采血法采取鹿全 血至離心瓶內，將離心瓶置于4~5°C下恒溫靜置5~6h; (2) 分離:將經（1)處理后的鹿全血在4~5°C的條件下，采用2000~3000rpm的轉速離心 40~50min，離心結束后在真空環境下從離心瓶中抽取血清，將該抽取所得的血清置于-25 ~-30°C下保存備用，得到冷凍的血清； (3) 去除纖維蛋白：將經（2)處理所得的冷凍血清置于4~5°C環境中融化，將融化后所 得血清通過多層無菌紗布過濾，收集濾液； (4) 滅活:將經(3)處理所得濾液置于56~60°C下恒溫水浴30~40min，水浴過程中隨時 晃動濾液； (5) 降低IgG濃度和葡萄糖含量:將經(4)處理后的濾液采用層析法將IgG濃度降低至小 于5μg/ml;然后采用能夠透析蛋白分子量為12000~14000的透析膜于0.15~0.18m〇VL的 NaCl水溶液中透析至葡萄糖含量小于0.5mg/ml; (6) 去除病毒和支原體及除菌過濾：將經（5)處理后的血清采用劑量為30~45KGy的γ 射線照射;然后將上述血清裝入連續流血漿滅菌器內，并用紫外線以45~50°照射該裝有血 清的連續流血漿滅菌器，照射同時將血清通過ΕΚ級無石棉蔡氏濾片得到濾液，然后再將該 濾液通過0.22~0.25μηι過濾膜過濾，最后經100~150nm過濾膜過濾，得到鹿血清。2. 根據權利要求1所述的鹿血清的分離制備方法，其特征在于:步驟（1)中待采血鹿為 身體狀況健康、精神狀態良好、無疫情史的成年鹿、小鹿和胎鹿中的一種。3. 根據權利要求1所述的鹿血清的分離制備方法，其特征在于:步驟（1)中采用2wt. % 碘酒和75vol. %酒精作為消毒液依次對待采血鹿進行鹿體全身清潔消毒。4. 根據權利要求1所述的鹿血清的分離制備方法，其特征在于:步驟(3)中采用八層無 菌紗布對融化所得血清進行過濾。5. 根據權利要求1所述的鹿血清的分離制備方法，其特征在于:步驟(4)中將濾液置于 56 °C下恒溫水浴30min。6. 根據權利要求1所述的鹿血清的分離制備方法，其特征在于:步驟(6)中所述連續流 血衆滅菌器的流速為250~270mL/min。7. -種根據權利要求1至6中任一權利要求所述分離制備方法制備所得的鹿血清。8. 根據權利要求7所述的鹿血清的應用，其特征在于:所述鹿血清在含血清細胞培養基 中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種鹿血清的分離制備方法，該方法將從清潔消毒后的待采血鹿無菌采血所得的鹿全血經靜置、離心分離、去除纖維蛋白、滅活、降低IgG濃度和葡萄糖含量后，將所得血清采用一定劑量的γ射線照射照射去除病毒和支原體后，并邊用紫外線照射除菌邊用無石棉蔡氏濾片過濾得到鹿血清濾液，最后采用過濾膜過濾得到成品鹿血清；該制備方法簡便快捷，工藝穩定且適于大批量生產，且所得鹿血清不含纖維蛋白，IgG濃度和葡萄糖含量低，能夠徹底杜絕病毒、病菌和支原體的污染，制備所得的鹿血清能夠用于含血清細胞培養液的制備。
【IPC分類】C12N5/00
【公開號】CN105647848
【申請號】
【發明人】黨平, 宋平, 陳建兵, 杜雨威, 王瑜
【申請人】蘇州紅冠莊藥物研究有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月25日