一種基于sis的細胞復合培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于SIS的細胞復合培養方法，屬于細胞生物技術領域。
【背景技術】
[0002]目前人造血管可采用的主要材料有:滌綸、聚四氟乙烯、聚丙烯、硅橡膠等，但現有人造血管材料的組織相容性較差，且容易引發感染、炎癥，因此組織相容性更好的人造血管材料是人們研究和尋找的方向。
[0003]SIS(小腸粘膜下層)是一種具有誘導/引導組織再生功能的膜材料，其用于修復重建膀胱、尿道、食管、骨及軟骨具有良好的組織相容性，目前已有采用SIS作為基質構建用于食管、骨及軟骨的組織工程材料的方法;HUVECs(人臍靜脈內皮細胞)是一種取自新生兒臍帶的血管內皮細胞，是血管內皮細胞體外實驗的常用材料，但其屬于低增長的細胞，在體外培養時存活及增值率較低，進行SIS與HUVECs的相容性，及HUVECs在SIS上的增殖、特性研究，對進行人造血管的組織工程材料研究有重要意義。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種基于SIS的細胞復合培養方法，能夠使HUVECs在SIS上大量增殖并緊密排列，并為研究組織相容性更高的人造血管材料提供基礎。
[0005]為解決上述技術問題，本發明提供一種基于SIS的細胞復合培養方法，包括以下步驟:
[0006]A、SIS的制備:采用abraham法制備小腸粘膜下層；
[0007]B、HUVECs的原代培養:取新生兒新鮮臍帶，磷酸鹽緩沖液沖洗后，用注射器灌洗臍靜脈，再將臍帶一端夾閉，從另一端用注射器向所述臍靜脈內注入消化酶溶液，消化后用注射器吸取消化液并收集，向所述消化液中加入含血清的培養液終止消化，吹打若干次后接種于培養瓶中，置37 °C 5 % CO2細胞培養箱中培養；
[0008]C、HUVECs與SIS的復合培養:取步驟A中獲得的SIS制成大小均等的SIS小塊，紫外燈照射消毒后放入細胞培養板中，用細胞培養液浸泡1-3天后，加入5-20%的牛血清，放入37°C細胞培養箱中孵育12-16h;取步驟B中培養的HUVECs，加入消化酶溶液消化后，收集消化液并加入含血清的培養液終止消化，將消化液離心后收集HUVECs細胞，并用含10-20 %牛血清的細胞培養液制成細胞懸液，將細胞懸液稀釋后種至放有SIS的細胞培養板中，放入370C 5 % CO2細胞培養箱內培養，每1-4天換液一次。
[0009]所述采用abraham法制備小腸粘膜下層的方法為:取豬小腸，清潔后去除小腸的漿膜層和肌層，將處理后的小腸在含有I OOmmo I /L乙二胺四乙酸和I Ommo I /LNaOH的溶液中浸泡12-18h，用去離子水將浸泡后的小腸清洗干凈，再用含有lmmol/L HCl和lmmol/L NaCl溶液中浸泡5?1h，用去離子水清洗后在含有lmmo 1/L NaCl的磷酸鹽緩沖液中浸泡12_18h，用去離子水清洗后在磷酸鹽緩沖液中浸泡l-4h，再用去離子水沖洗2h，將制得的SIS在含有0.1 %過氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡6-1 Oh，用含有0.05%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液清洗1-4h，冷凍干燥后用γ射線照射消毒。
[0010]所述消化酶溶液為0.25%的胰蛋白酶溶液。
[0011]步驟B中的所述培養瓶內預鋪有鼠尾膠原。
[0012]步驟C中所述細胞培養板為6孔板，所述細胞懸液的接種密度為2?5Χ15/孔。
[0013]步驟C中所述SIS小塊的大小為2.5cm X 2.5cm。
[0014]本發明所達到的有益效果在于:
[0015]1.SIS主要有〗、m型膠原蛋白構成，有良好的細胞相容性，能促進可促進HUVECs的粘附、生長和分化，因此HUVECs可生長為排列緊密的細胞層；
[0016]2.SIS具有無抗原性，用于移植不會導致免疫反應，HUVECs來源于胎兒臍帶，材料較易獲取，因此以SIS和HUVECs作為人造血管的組織工程材料，具有更好的組織相容性。
[0017]因此，本發明所提供的一種基于SIS的細胞復合培養方法，材料較易獲取，能夠使HUVECs在SIS上大量增殖并緊密排列，并為研究組織相容性更高的人造血管材料提供基礎。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例對本發明作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明的技術方案，而不能以此來限制本發明的保護范圍。
[0019]實施例一:
[0020]—種基于SIS的細胞復合培養方法，包括以下步驟:
[OO21 ] A、SIS的制備:采用abraham法制備小腸粘膜下層；
[0022]B、HUVECs的原代培養:取新生兒新鮮臍帶，磷酸鹽緩沖液沖洗后，用注射器灌洗臍靜脈，再將臍帶一端夾閉，從另一端用注射器向所述臍靜脈內注入消化酶溶液，消化后用注射器吸取消化液并收集，向所述消化液中加入含血清的培養液終止消化，吹打若干次后接種于培養瓶中，置37 °C 5 % CO2細胞培養箱中培養；
[0023]C、HUVECs與SIS的復合培養:取步驟A中獲得的SIS制成大小均等的SIS小塊，紫外燈照射消毒后放入細胞培養板中，用細胞培養液浸泡I天后，加入5%的牛血清，放入37°C細胞培養箱中孵育16h;取步驟B中培養的HUVECs，加入消化酶溶液消化后，收集消化液并加入含血清的培養液終止消化，將消化液離心后收集HUVECs細胞，并用含10 %牛血清的細胞培養液制成細胞懸液，將細胞懸液稀釋后種至放有SIS的細胞培養板中，放入37°C5%C02細胞培養箱內培養，每I天換液一次。
[0024]所述采用abraham法制備小腸粘膜下層的方法為:取豬小腸，清潔后去除小腸的漿膜層和肌層，將處理后的小腸在含有I OOmmo I /L乙二胺四乙酸和I Ommo I /LNaOH的溶液中浸泡12h，用去離子水將浸泡后的小腸清洗干凈，再用含有lmmo I /L HCl和lmmo I /L NaCl溶液中浸泡5h，用去離子水清洗后在含有lmmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液中浸泡12h，用去離子水清洗后在磷酸鹽緩沖液中浸泡lh，再用去離子水沖洗2h，將制得的SIS在含有0.1%過氧乙酸的20 %乙