醇溶液中浸泡6h，用含有0.05 %疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液清洗Ih，冷凍干燥后用γ射線照射消毒。
[0025]所述消化酶溶液為0.25 %的胰蛋白酶溶液。
[0026]步驟B中的所述培養瓶內預鋪有鼠尾膠原。
[0027]步驟C中所述細胞培養板為6孔板，所述細胞懸液的接種密度為2X 15/孔。
[0028]步驟C中所述SIS小塊的大小為2.5cm X 2.5cm。
[0029]實施例二
[0030]—種基于SIS的細胞復合培養方法，包括以下步驟:
[0031]A、SIS的制備:采用abr aham法制備小腸粘膜下層；
[0032]B、HUVECs的原代培養:取新生兒新鮮臍帶，磷酸鹽緩沖液沖洗后，用注射器灌洗臍靜脈，再將臍帶一端夾閉，從另一端用注射器向所述臍靜脈內注入消化酶溶液，消化后用注射器吸取消化液并收集，向所述消化液中加入含血清的培養液終止消化，吹打若干次后接種于培養瓶中，置37 °C 5 % CO2細胞培養箱中培養；
[0033]C、HUVECs與SIS的復合培養:取步驟A中獲得的SIS制成大小均等的SIS小塊，紫外燈照射消毒后放入細胞培養板中，用細胞培養液浸泡3天后，加入20%的牛血清，放入37°C細胞培養箱中孵育12h;取步驟B中培養的HUVECs，加入消化酶溶液消化后，收集消化液并加入含血清的培養液終止消化，將消化液離心后收集HUVECs細胞，并用含20 %牛血清的細胞培養液制成細胞懸液，將細胞懸液稀釋后種至放有SIS的細胞培養板中，放入37°05%0)2細胞培養箱內培養，每4天換液一次。
[0034]所述采用abraham法制備小腸粘膜下層的方法為:取豬小腸，清潔后去除小腸的漿膜層和肌層，將處理后的小腸在含有I OOmmo I /L乙二胺四乙酸和I Ommo I /LNaOH的溶液中浸泡18h，用去離子水將浸泡后的小腸清洗干凈，再用含有lmmo I /L HCl和lmmo I /L NaCl溶液中浸泡1h，用去離子水清洗后在含有lmmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液中浸泡18h，用去離子水清洗后在磷酸鹽緩沖液中浸泡4h，再用去離子水沖洗2h，將制得的SIS在含有0.1%過氧乙酸的20 %乙醇溶液中浸泡I Oh，用含有0.05%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液清洗4h，冷凍干燥后用γ射線照射消毒。
[0035]所述消化酶溶液為0.25 %的胰蛋白酶溶液。
[0036]步驟B中的所述培養瓶內預鋪有鼠尾膠原。
[0037]步驟C中所述細胞培養板為6孔板，所述細胞懸液的接種密度為5X 15/孔。
[0038]步驟C中所述SIS小塊的大小為2.5cm X 2.5cm。
[0039]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變形，這些改進和變形也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種基于SI S的細胞復合培養方法，其特征在于:包括以下步驟: A、SIS的制備:采用abraham法制備小腸粘膜下層； B、HUVECs的原代培養:取新生兒新鮮臍帶，磷酸鹽緩沖液沖洗后，用注射器灌洗臍靜脈，再將臍帶一端夾閉，從另一端用注射器向所述臍靜脈內注入消化酶溶液，消化后用注射器吸取消化液并收集，向所述消化液中加入含血清的培養液終止消化，吹打若干次后接種于培養瓶中，置37 °C 5% CO2細胞培養箱中培養； C、HUVECs與SIS的復合培養:取步驟A中獲得的SIS制成大小均等的SIS小塊，紫外燈照射消毒后放入細胞培養板中，用細胞培養液浸泡1-3天后，加入5-20%的牛血清，放入37°C細胞培養箱中孵育12_16h;取步驟B中培養的HUVECs，加入消化酶溶液消化后，收集消化液并加入含血清的培養液終止消化，將消化液離心后收集HUVECs細胞，并用含10-20%牛血清的細胞培養液制成細胞懸液，將細胞懸液稀釋后種至放有SIS的細胞培養板中，放入37°C5 % CO2細胞培養箱內培養，每1-4天換液一次。2.如權利要求1所述的一種基于SIS的細胞復合培養方法，其特征在于:所述采用abraham法制備小腸粘膜下層的方法為:取豬小腸，清潔后去除小腸的漿膜層和肌層，將處理后的小腸在含有10mmoI/L乙二胺四乙酸和1mmoI/LNaOH的溶液中浸泡12_18h，用去離子水將浸泡后的小腸清洗干凈，再用含有ImmoI/L HCl和Immo I/L NaCl溶液中浸泡5?1h，用去離子水清洗后在含有lmmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液中浸泡12_18h，用去離子水清洗后在磷酸鹽緩沖液中浸泡I _4h，再用去離子水沖洗2h，將制得的SIS在含有0.1%過氧乙酸的20 %乙醇溶液中浸泡6-10h，用含有0.05%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液清洗l-4h，冷凍干燥后用γ射線照射消毒。3.如權利要求1所述的一種基于sis的細胞復合培養方法，其特征在于:所述消化酶溶液為0.25 %的胰蛋白酶溶液。4.如權利要求1所述的一種基于SIS的細胞復合培養方法，其特征在于:步驟B中的所述培養瓶內預鋪有鼠尾膠原。5.如權利要求1所述的一種基于SIS的細胞復合培養方法，其特征在于:步驟C中所述細胞培養板為6孔板，所述細胞懸液的接種密度為2?5 X 15/孔。6.如權利要求1所述的一種基于SIS的細胞復合培養方法，其特征在于:步驟C中所述SIS小塊的大小為2.5cm X 2.5cm。
【專利摘要】本發明公開了一種基于SIS的細胞復合培養方法，包括以下步驟：采用abraham法制備小腸粘膜下層，？原代法進行HUVECs的培養，將SIS制成大小均等的SIS小塊，將HUVECs細胞種至放有SIS的細胞培養板中，放入37℃5%CO2細胞培養箱內培養。本發明所提供的一種基于SIS的細胞復合培養方法，材料較易獲取，能夠使HUVECs在SIS上大量增殖并緊密排列，并為研究組織相容性更高的人造血管材料提供基礎。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105647849
【申請號】
【發明人】韓立軍
【申請人】江蘇期佰醫療技術有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月25日