圖2,分別為本實施例的高純度新生仔豬生殖干細胞的獲取技術路線 圖和模式圖，本實施例利用差速貼壁法高效獲取新生仔豬生殖干細胞，具體步驟如下：
[0031] 1、取新生仔豬（l-5d)睪丸組織，去掉脂肪墊白膜和結締組織；
[0032] 2、剪刀剪碎睪丸組織，通過0.25wt %的胰蛋白酶和lmg/mL的膠原蛋白酶消化法獲 得單細胞懸液，單細胞懸液中展現出大量大小不一的細胞(如圖3A);
[0033] 3、利用差速貼壁法(0.1mg/ml多聚賴氨酸）將睪丸組織中貼壁能力強的成纖維類 的細胞(其中包括支持細胞，間質細胞，類肌細胞和血管淋巴管上皮細胞)貼壁而被高效短 時間的地去除（如圖3B);
[0034] 4、差速貼壁5次以后基本都是不貼壁的細胞，收集這些未貼壁細胞，里面含有淋巴 細胞和紅細胞和相對高比例的mGSCs (如圖3C);
[0035] 5、利用Percoll密度梯度離心方法可將密度不同的淋巴細胞和碎片（如圖3D)、紅 細胞與生殖干細胞分開(如圖3E);最終得到相對純的豬生殖干細胞(如圖3F);通過堿性磷 酸酶染色，結果染色呈陽性（如圖3G)。所述Percoll密度梯度離心方法為:配置20 %和40 % 的兩個梯度的Percoll離心液，底層加入40%Percoll液，上層加入20%的Percol 1液，離心 后，生殖干細胞處于40 %Perc〇l 1液頂部，也就是20 %Perc〇l 1液底部，而紅細胞離心后處于 離心管底部，淋巴和細胞碎片在20%Perc〇ll液面頂部，達到分離的目的。
[0036]實施例2實施例1新分離的生殖干細胞的純度分析
[0037] 通過流式細胞術分析，表達GFRA1、0CT4、PLZF和c-KIT四個蛋白的豬mGSCs的比例， 實驗結果顯示特異性豬1^3〇8的三個蛋白（6?1^1、0(^4和?1^?)均在85%以上，而分化標志 蛋白c-KIT基本不表達(如圖4)，說明了使用實施例1的方法可以高效的純化mGSCs。
[0038]實施例3實施例1的生殖干細胞的組織化學染色與免疫熒光檢測 [0039]純化的豬mGSCs免疫熒光染色后，共聚焦顯微鏡觀察膜蛋白GFRA1和細胞核內的蛋 白0CT4和PLZF(如圖5A)所在對應的位置，而不表達c-KIT，而免疫組織化學顯示出了這三個 蛋白特異的表達在曲細精管內側(如圖5B)，這證明了采用實施例1的方法高效地富集了特 征的豬mGSCs。
[0040]實施例4實施例1的生殖干細胞的生殖標記檢測和分析
[0041 ] 根據已報道mGSCs的基因標記，對豬mGSCs進行分析。結果顯示它表達0ct4、Sox2、 Nanog、Lin28、c_Myc、Klf4、Prdml4、Sall4、Stat3、Plzf、Vasa、Esrrb、Texll、Nanos3、 Sohlh2、Thy-l等基因，而豬胎兒成纖維細胞(PEF)只表達c-Myc、Klf4、Stat3和Texll(如圖 6A);免疫熒光染色結果顯示新分離豬mGSCs還表達CD29、CD90、NAN0G和PGP9.5(如圖6B)等 蛋白，進一步說明了采用實施例1的方法高效地富集了特征的豬mGSCs。
[0042] 其中，豬基因 （sus scrofa)RT_PCR引物信息如表1:
[0043] 表1豬基因 RT-PCR引物
[0044]
[0046]
[0047] 注:所有引物退火溫度均設計在60°C。
[0048] 本發明所建立高效富集新生仔豬mGSCs方法在豬mGSCs生物學性質研究的科研平 臺、和豬mGSCs介導的動物育種、品種改良和瀕危品種保存等方面具有潛在的應用前景，豬 是人類醫學理想的動物模型，材料豐富，獲取方便，成本低，建立豬mGSCs成熟方法，對于人 和其他家畜動物mGSCs研究具有很好的指導作用。本發明結合傳統的差速貼壁法和密度梯 度離心法，在探索了不同時間點和不同貼壁方案及其梯度離心的條件下，優化建立起一套 有效的新生仔豬mGSCs的分離純化方法，操作簡單，重復性好，細胞純度可達到85%以上，純 化結果顯示細胞形態均勻，該方法對比以往的分離方法具有明顯優勢。
[0049] 以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 、通過胰蛋白酶和膠原蛋白酶的兩步酶消化法獲得新生仔豬的睪丸組織單細胞懸 液； (2) 、利用差速貼壁法使睪丸組織中貼壁能力強的成纖維類的細胞貼壁而被去除； (3) 、差速貼壁5次以上，收集未貼壁細胞，所述未貼壁細胞中含有淋巴細胞、紅細胞和 生殖干細胞； (4) 、利用Percoll密度梯度離心方法將密度不同的淋巴細胞和紅細胞與生殖干細胞分 離，即得純的生殖干細胞。2. 根據權利要求1所述的新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法，其特征在于，步驟 (1) 中所述胰蛋白酶的濃度為〇. 25wt %，所述膠原蛋白酶的濃度lmg/mL。3. 根據權利要求1所述的新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法，其特征在于，步驟 (2) 中所述差速貼壁法中所用的多聚賴氨酸的濃度為0. lmg/ml。4. 根據權利要求1所述的新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法，其特征在于，步驟 (3) 中所述差速貼壁的次數為5次。5. 根據權利要求1所述的新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法，其特征在于，步驟 (4) 中所述密度梯度離心方法為：配置20 %和40 %兩個梯度的Percoll離心液，底層加入 40 %Perc〇l 1液，上層加入20 %的Percol 1液，離心后，生殖干細胞處于40 %Perc〇l 1液頂部， 而紅細胞離心后處于離心管底部，淋巴細胞在20%Perc〇ll液面頂部。6. 根據權利要求1~5任一項所述的新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法，其特征 在于，步驟(1)中所述睪丸組織為去掉了脂肪墊白膜和結締組織的睪丸組織。7. 根據權利要求1~5任一項所述的新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法，其特征 在于，所述新生仔豬為1~5天的新生仔豬。
【專利摘要】本發明公開了一種新生仔豬睪丸生殖干細胞(mGSCs)的高效獲取方法，其包括以下步驟：通過兩步酶法消化獲取新生仔豬的睪丸組織單細胞懸液；利用差速貼壁法去除睪丸組織中成纖維類的貼壁細胞；差速貼壁5次以后，收集未貼壁細胞，所述未貼壁細胞中含有淋巴細胞、紅細胞和mGSCs；利用密度梯度離心方法將淋巴細胞和紅細胞與mGSCs分離，即得到高純度的mGSCs。本發明的方法操作簡單，重復性好，成功率高，高效的獲取高比例的mGSCs，對于后期研究mGSCs性質及其應用具有重要作用。不僅可應用于豬mGSCs生物學性質研究的科研平臺、也可以在豬mGSCs介導的動物育種、品種改良和瀕危品種保存等方面具有潛在的應用前景。
【IPC分類】C12N5/076
【公開號】CN105647855
【申請號】
【發明人】白銀山, 張守全, 朱翠, 馮美瑩, 衛恒習, 李莉
【申請人】華南農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月16日