一種干細胞培養試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于干細胞培養領域，具體涉及一種干細胞培養試劑盒。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。
[0003]間充質干細胞包括臍帶間充質干細胞和骨髓間充質干細胞。
[0004]臍帶間充質干細胞是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的干細胞，具有來源廣泛、易于采集、保存和運輸、無異體排斥、避免倫理爭議等諸多優點。流式細胞儀分析發現臍帶間充質干細胞高表達間質細胞標志(⑶44、CD105)、整合素受體(⑶29、CD49b、⑶49c、⑶51)、不表達造血系標志(⑶34、CD45)白細胞抗原HLA-DR和內皮細胞標志CD31。臍帶間充質干細胞在體內外可以分化為骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞以及神經元細胞等。目前人臍帶間充質干細胞在組織工程骨、人工血管以及基因治療等臨床應用研究中已逐漸深入，并已顯示出廣闊的應用前景。目前，對臍帶間充質干細胞的分離培養、擴增還沒有統一的標準，存在純度低、原代培養時間長等缺點。各種類型的成纖維成體干細胞擴增一般在2?3天開始進入指數式生長，相差不大，而原代細胞由于組織來源不同，出現細胞克隆時間差異較大，所以，原代細胞傳代時間是分離得到目的細胞的關鍵。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種能夠提高間充質干細胞原代細胞傳代時間的干細胞培養試劑盒，以使間充質干細胞多次傳代后依然保持有細胞全能性。
[0006]本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的:
[0007]—種干細胞培養試劑盒，包括細胞培養液A和細胞培養液B;
[0008]所述細胞培養液A為含80?120ng/ml細胞因子LIF、80?120ng/ml細胞因子bFGF和20?30yg/ml Pedinophyllol J的Knockout-DMEM培養基；
[0009]所述細胞培養液B為胎牛血清。
[0010]進一步地，所述細胞培養液A為含100ng/ml細胞因子LIF、100ng/ml細胞因子bFGF和25yg/ml Pedinophyllol J的Knockout-DMEM培養基。
[0011 ]進一步地，所述干細胞為臍帶間充質干細胞。
[0012]進一步地，所述干細胞為骨髓間充質干細胞。
[0013]進一步地，所述細胞培養液A和細胞培養液B均為無菌，并各自獨立包裝。
[0014]進一步地，所述的干細胞培養試劑盒還包括細胞洗滌液和細胞消化液;所述細胞洗滌液為生理鹽水;所述細胞消化液為Collagenase II水溶液。
[0015]進一步地，所述細胞消化液為濃度為0.2g/100ml的Collagenase II水溶液。
[0016]進一步地，所述生理鹽水由氯化鈉和水組成，氯化鈉的濃度為0.9g/100ml。
[0017]進一步地，所述細胞培養液A、細胞培養液B、細胞洗滌液和細胞消化液均為無菌，并各自獨立包裝。
[0018]上述干細胞培養試劑盒在間充質干細胞培養中的應用。
[0019]本發明的優點:
[0020]本發明提供的培養試劑盒能夠提高間充質干細胞原代細胞傳代時間，使間充質干細胞多次傳代后依然保持有細胞全能性。
【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0022]本發明化合物Pedinophyllol J的制備方法參見文獻:Highly Oxygenated ent-Pimarane-Type Diterpenoids from the Chinese Liverwort PedinophylIuminterruptum and Their Allelopathic Activities，J.Nat.Prod.2013，76，1647_16530
[0023]實施例1:試劑盒的制備
[0024]1、組分的制備
[0025]細胞洗滌液的制備:將9gNaCl溶于去離子水并用去離子水定容至1000ml，高壓滅囷后置于4 C冰箱內備用。
[0026]細胞培養液A的制備:將細胞因子LIF、細胞因子bFGF和化合物Pedinophyllol J溶于無菌Knockout-DMEM培養基(液體)，細胞因子LIF的濃度為100ng/ml，細胞因子bFGF的濃度為100ng/ml，化合物Pedinophyllol J的濃度為25yg/ml。置于4°C冰箱內備用。
[0027]細胞培養液B為無菌胎牛血清，置于-20V冰箱內備用。
[0028]細胞消化液:將Collagenase II溶于去離子水使CollagenaseII的濃度為0.2g/100ml，置于4°C冰箱內備用。
[0029]2、組分的分裝以及試劑盒的制備
[0030]干細胞試劑盒(I次/盒)由獨立包裝的如下組分組成:I瓶細胞洗滌液(10ml/瓶)、I瓶細胞培養液A(80ml/瓶)，I瓶細胞培養液B(20ml/瓶)和I瓶細胞消化液(10ml/瓶)。
[0031]實施例2:試劑盒的制備，與實施例1對比，僅細胞培養液A中不添加PedinophyllolJ
[0032]1、組分的制備
[0033]細胞洗滌液的制備:將9gNaCl溶于去離子水并用去離子水定容至1000ml，高壓滅囷后置于4 C冰箱內備用。
[0034]細胞培養液A的制備:將細胞因子LIF和細胞因子bFGF溶于無菌Knockout-DMEM培養基(液體)，細胞因子LIF的濃度為100ng/ml，細胞因子bFGF的濃度為100ng/ml。置于4°C冰箱內備用。
[0035]細胞培養液B為無菌胎牛血清，置于-200C冰箱內備用。
[0036]細胞消化液:將Collagenase II溶于去離子水使CollagenaseII的濃度為0.2g/100ml，置于4°C冰箱內備用。
[0037]2、組分的分裝以及試劑盒的制備
[0038]干細胞試劑盒(I次/盒)由獨立包裝的如下組分組成:I瓶細胞洗滌液(10ml/瓶)、I瓶細胞培養液A(80ml/瓶)，I瓶細胞培養液B(20ml/瓶)和I瓶細胞消化液(10ml/瓶)。
[0039]實施例3:臍帶間充質干細胞的