分離與快速擴增培養
[0040]分別用實施例1(實驗組)和實施例2(對照組)制備的試劑盒進行臍帶間充質干細胞的分離與快速擴增培養。
[0041 ]細胞培養液的制備:將細胞培養液A和細胞培養液B按照5:1的體積比混合。
[0042]1、無菌收集離體臍帶(來源為人)，浸沒于含雙抗的細胞培養液(含雙抗的細胞培養液由細胞培養液、青霉素和鏈霉素組成，青霉素的濃度為lg/100ml、鏈霉素的濃度為Ig/10ml)中，玻璃容器密封運輸至實驗室。
[0043]2、在生物安全柜中剪取約1cm長的臍帶，用細胞洗滌液清洗血污；用解剖刀去除外被羊膜、2條臍靜脈和I條臍動脈，得到華爾通氏膠(動靜脈之間的胚胎粘液樣結締組織)。
[0044]3、將華爾通氏膠剪碎成肉糜狀，轉移到離心管中，加入20ml細胞消化液，混勻37°C過夜消化(約6小時)；吸取液相、離心(2500rpm，5分鐘)，收集沉淀(原代細胞)。
[0045]4、用細胞培養液重懸原代細胞，接種于0.2%明膠包被的培養瓶中(每16個細胞接種到I個25cm2培養瓶)，置于37°C,5%CO2培養箱中培養;持續觀察細胞貼壁生長情況，細胞多數貼壁后(約24小時)更換為新的細胞培養液，除去未貼壁細胞和雜質，以后每3天半量更換細胞培養液(半量即原細胞培養液體積的一半;也可每4天半量更換細胞培養液)，原代細胞培養7天后細胞密度達到90%。
[0046]5、原代細胞培養至細胞密度達到90%后進行第一次傳代，之后均在細胞密度達到90% (培養2?3天)時進行傳代;繼續傳代20次(即第一次傳代后，又連續傳代了 19次)。
[0047]實施例4:細胞純度測定
[0048]分別取實施例1(實驗組)和實施例2(對照組)制備的試劑盒按實施例3方法分離培養傳代20次的細胞進行流式細胞儀檢測，以驗證細胞樣本的純度。
[0049]通過流式細胞儀分別檢測第20次傳代后的細胞樣本的表面抗原CD29的圖譜，實驗組細胞樣本的陽性率為96.6%，而對照組細胞樣本的陽性率僅為80.8%o結果表明，采用本發明提供的細胞培養液將原代細胞傳代20次后，細胞的純度依然非常高。
[0050]實施例5:全能性驗證
[0051]為證實臍帶間充質干細胞的多向分化潛能，本實施例對實施例3中第15次傳代后的細胞樣本向成骨細胞和脂肪細胞分化的潛能進行鑒定。
[0052]1、向成骨細胞分化
[0053]將細胞樣本以3000cells/cm2接種，然后加入成骨誘導培養基(向Knock out-DMEM培養基中添加地塞米松至100nM、抗壞血酸至50μΜ、β-甘油磷酸鈉至10mM)，于37°C、5%⑶2培養箱中培養，大約5?7天后觀察。
[0054]結果實驗組可觀察到如下現象:細胞匯合成單層，細胞突起互相連接，并可重疊生長而不發生接觸抑制；重疊生長的細胞逐漸形成結節狀，隨后膠原堆積及鈣鹽沉積，細胞間出現致密的圓形不透光團塊物質，表明細胞樣本可以向成骨細胞分化。
[0055]對照組未觀察到實驗組所見現象，說明使用實施例2制備的試劑盒所培養的臍帶間充質干細胞傳代15代后基本喪失繼續分化為成骨細胞的能力。
[0056]2、向脂肪細胞分化
[0057]將細胞樣本以3000cells/cm2接種，然后加入成脂肪誘導培養基(向Knockout-DMEM培養基中添加地塞米松至ΙμΜ、甲基-異丁基黃嘌呤至0.5mM、胰島素至10yg/ml、吲哚美辛至ΙΟΟμΜ)，持續培養。
[0058]結果實驗組可見如下現象:第2天細胞匯合成單層;2周后部分細胞形態變圓，胞漿內出現亮圓形脂滴;隨著時間延長，圓形細胞逐漸增多。表明細胞樣本可向脂肪細胞分化。
[0059]對照組未觀察到實驗組所見現象，說明使用實施例2制備的試劑盒所培養的臍帶間充質干細胞傳代15代后基本喪失繼續分化為脂肪細胞的能力。
[0060]以上結果表明，采用本發明提供的細胞培養液將臍帶間充質干細胞傳代15次后，細胞仍然維持很高的純度和良好的全能性。
[0061]采用本發明提供的細胞培養液培養骨髓間充質干細胞，也取得了同樣好的效果。
[0062]上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1.一種干細胞培養試劑盒，其特征在于:包括細胞培養液A和細胞培養液B; 所述細胞培養液A為含80?120ng/ml細胞因子LIF、80?120ng/ml細胞因子bFGF和20?30yg/ml Pedinophyllol J的Knockout-DMEM培養基； 所述細胞培養液B為胎牛血清。2.根據權利要求1所述的干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述細胞培養液A為含100ng/ml細胞因子LIF、100ng/ml細胞因子bFGF和25yg/ml Pedinophyllol J^Knockout-DMHM培養基。3.根據權利要求1所述的干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述干細胞為臍帶間充質干細胞。4.根據權利要求1所述的干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述干細胞為骨髓間充質干細胞。5.根據權利要求1所述的干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述細胞培養液A和細胞培養液B均為無菌，并各自獨立包裝。6.根據權利要求1所述的干細胞培養試劑盒，其特征在于:還包括細胞洗滌液和細胞消化液;所述細胞洗滌液為生理鹽水;所述細胞消化液為Collagenase II水溶液。7.根據權利要求6所述的干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述細胞消化液為濃度為0.2g/100ml的Collagenase II水溶液。8.根據權利要求6所述的干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述生理鹽水由氯化鈉和水組成，氯化鈉的濃度為0.9g/100ml。9.根據權利要求6所述的干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述細胞培養液A、細胞培養液B、細胞洗滌液和細胞消化液均為無菌，并各自獨立包裝。10.權利要求1?9任一所述的干細胞培養試劑盒在間充質干細胞培養中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種干細胞培養試劑盒，包括細胞培養液A和細胞培養液B；所述細胞培養液A為含80～120ng/ml細胞因子LIF、80～120ng/ml細胞因子bFGF和20～30μg/ml？Pedinophyllol？J的Knockout-DMEM培養基；所述細胞培養液B為胎牛血清。采用本發明提供的細胞培養液將臍帶間充質干細胞傳代15次后，細胞仍然維持很高的純度和良好的全能性。采用本發明提供的細胞培養液培養骨髓間充質干細胞，也取得了同樣好的效果。這些結果表明，本發明提供的培養試劑盒能夠提高間充質干細胞原代細胞傳代時間，使間充質干細胞多次傳代后依然保持有細胞全能性。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105647861
【申請號】
【發明人】趙慧慧
【申請人】趙慧慧
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月31日