一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培養nk細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞培養領域，尤其涉及一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培養NK 細胞的方法。
【背景技術】
[0002] NK細胞屬于大顆粒淋巴細胞，來源于骨髓，占外周血淋巴細胞總數的5%_10%，是 機體重要的免疫細胞，具有廣譜抗腫瘤細胞作用。NK細胞不依賴于抗原刺激作用就可以非 特異直接殺傷腫瘤細胞和病毒感染的靶細胞，對肺癌、肝癌、卵巢癌、食道癌、結腸癌、胃癌、 宮頸癌、骨癌等均有效果。NK細胞對造血細胞來源的腫瘤細胞更為敏感，對淋巴瘤和白血病 細胞的作用更為明顯。因此，NK細胞在機體免疫監視和早期抗感染免疫過程中起重要作用， 是抗瘤免疫的第一線細胞，能迅速溶解某些腫瘤細胞。
[0003] 目前，臨床試驗顯示NK細胞過繼免疫治療惡性腫瘤具有良好的應用前景。NK細胞 過繼免疫治療療法是采用特殊的培養方法，把癌患者本身的NK細胞在體外培養增殖，使細 胞數目擴大數千倍且細胞毒活性極大增強后，再回輸到患者的體內，是一種簡單有效、安全 又積極的最新強力治癌療法。
[0004] 如今，很多實驗室嘗試大規模培養NK細胞，以便用于臨床腫瘤的治療，從外周血中 分離得到單個核細胞，用培養基接種到培養瓶中，通過添加 IL-2等細胞因子促進NK細胞在 體外大量擴增，再分裝到培養瓶中或者培養袋中擴增培養。現有NK細胞的培養規模小，操作 復雜，步驟繁瑣，擴增倍數低，所擴增得到的數量不夠用于臨床治療，而且培養密度不能過 高，浪費培養基，不利于節約成本和培養空間。此外表面抗原表達量低，殺傷效果差。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培 養NK細胞的方法。
[0006] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0007] 一種使用生物反應器培養NK細胞的方法，攪拌槳外包裹有減小剪切力的材料。 [0008]優選地，所述使用生物反應器培養NK細胞的方法，包括以下步驟：
[0009]用X-VIV0 15培養基將種子NK細胞按照1 X 106cellS/ml的密度接種于培養瓶中， 分別添加1 %培養基體積的IL-15溶液、IL-2溶液和0KT-3溶液，在37 °C、5 % C02條件下培養， 當培養體系達到一定體積后，轉入生物反應器中繼續培養至兩周，每2~3天補充適量的培 養基、IL-2 和 IL-15;
[0010] 所述IL-15溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。
[0011] 優選地，所述IL-15溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶液的濃度為300U/ml，0KT-3溶液 的濃度為500U/ml。
[0012]優選地，當培養體系大于500ml時，轉入2L生物反應器中繼續培養。
[0013] 優選地，在生物反應器中培養NK細胞的條件為:溶氧量為50%，pH7.2,攪拌速度為 45rpm〇
[0014] 優選地，所述種子NK細胞通過以下方法獲得：
[0015]外周血和生理鹽水按體積比1:1進行稀釋得到血液稀釋液，將其加至二分之一倍 體積的淋巴細胞分離液上方，升降速調為0,800g離心30min，取單個核細胞層，用RPMI1640 培養基清洗兩次，棄上清后用Stem cell免疫磁珠細胞分選試劑盒(購自瀚湖細胞有限公 司）分選NK細胞。具體方法為：用新鮮配制的NK細胞分選Buffer重懸細胞，將細胞密度調整 為5 X 107cells/ml，并轉移至1.5ml EP管中；按照50μ1/ηι1的抗體加入量，加入混合抗體后 輕輕混勻，室溫下孵育lOmin;將磁珠吹打均勻后，按照100μΙ/ml的磁珠加入量，加入磁珠后 輕輕混勻，室溫孵育5min;將細胞懸液轉移到分選專用的5ml圓底管中，加入NK細胞分選 Buffer至2.5ml，輕輕吹打均勾后，插入到磁極中（不蓋蓋子），靜置2.5min;將圓底管連同磁 極一并拿起，傾倒細胞懸液至新的15ml離心管中，400g離心5min;棄上清，加入5ml 1640培養 基重懸細胞，得到種子NK細胞。
[0016] -種生物反應器攪拌槳，所述攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。
[0017] -種生物反應器，所述生物反應器的攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。
[0018] 優選地，所述減小剪切力的材料為醫用硅膠管或食用橡膠管。
[0019] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0020] 1、本發明使用生物反應器培養NK細胞，在攪拌槳外包裹可以減小剪切力的材料， 可以降低細胞受到的剪切力傷害，有利于細胞大量擴增。
[0021 ] 2、本發明使用生物反應器培養NK細胞，在培養過程中不停的攪拌，為動態系統，有 利于細胞進行氣體交換和為細胞提供均一的培養環境，有利于細胞大量擴增。
[0022] 3、本發明使用生物反應器培養NK細胞，在保證細胞質量的前提下，能夠顯著提高 細胞培養密度，有利于節約培養基和培養空間。
[0023] 4、本發明使用生物反應器培養NK細胞，更接近人體內三維生長環境，與使用培養 瓶、培養袋等細胞貼壁生長的培養方式相比，更利于細胞大量擴增，可以大規模培養NK細 胞，而且所得NK細胞表面抗原表達量較高，對腫瘤細胞的殺傷活性較強。
【附圖說明】
[0024]圖1為各實施例和對比例培養的NK細胞對K562細胞的殺傷活性結果。
【具體實施方式】
[0025]為了更好的說明本發明，下面結合附圖和具體實施例做進一步說明。本發明中所 用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領域所熟知的，在此不再贅述。 [0026] 種子NK細胞可以使用現有任何方法獲得。本發明中種子NK優選通過以下方法制 備：
[0027]把60ml外周血轉移至離心管中，用生理鹽水按體積比1:1進行稀釋，得到血液稀釋 液;在一新離心管中加入淋巴細胞分離液，把血液稀釋液緩慢添加至淋巴細胞液層上方，形 成明顯的分界線，其中，淋巴細胞分離液與血液稀釋液的體積比為1:2;升降速調為0,800g 離心30min，離心結束后，用巴氏吸管小心抽取單個核細胞層至另一新離心管中，往該離心 管中添加 RPMI1640培養基清洗細胞，300g離心5min，棄上清，再次添加 RPMI1640培養基清洗 細胞，300g離心5min，棄上清。使用Stem cell免疫磁珠細胞分選試劑盒(購自瀚湖細胞有限 公司）分選NK細胞，具體方法為：用新鮮配制的NK細胞分選Buffer重懸細胞，將細胞密度調 整為5 X 107cellS/ml，并轉移至1.5ml EP管中；按照50yl/ml的抗體加入量，加入混合抗體 后輕輕混勻，室溫下孵育lOmin;將磁珠吹打均勻后，按照100μΙ/ml的磁珠加入量，加入磁珠 后輕輕混勻，室溫孵育5min;將細胞懸液轉移到分選專用的5ml圓底管中，加入NK細胞分選 Buffer至2.5ml，輕輕吹打均勾后，插入到磁極中（不蓋蓋子），靜置2.5min;將圓底管連同磁 極一并拿起，傾倒細胞懸液至新的1 5ml離心管中，400g離心5min ;棄上清，加入5ml RPMI1640培養基重懸細胞得到種子NK細胞懸液。取少量種子NK細胞懸液用臺盼藍染色法計 數。
[0028] 實施例1
[0029]自2L生物反應器(購自北京元唐盛興科技有限公司，美國BELLCO)中取出攪拌槳， 在攪拌槳外套上醫用硅膠管，紫外照射滅菌后，重新將攪拌槳裝回生物反應器內。使用該生 物反應器培養NK的方法如下：
[0030] 取2X 107個種子NK細胞，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIVO 15培養基接種于 T75培養瓶中，并添加 IL-15溶液、IL-2溶液和0KT-3溶液，IL-15溶液、IL-2溶液和0KT-3溶液 的用量分別為培養基體積的1%，在37°C、5%C02條件下培養，根據細胞的擴增情況，進行分 瓶培養，當培養體系總量大于500ml時，將其轉入2L生物反應器中，按照溫度37°C，C0