臨床治療級人胎盤底蛻膜來源的間充質干細胞(PDB-MSCs)無血清體外提取制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物干細胞技術，組織工程領域。涉及一種體外構建高模擬體內貼附 環境分離篩選，PDB-MSCs的培養、擴增技術。特別公開發明了一種臨床治療級人胎盤底蛻膜 層來源的間充質干細胞(PDB-MSCs)的高擬體內貼附環境細胞外基質附著體外提取制備方 法，發明特征包括體外分離及規模化培養擴增與保存的方法。通過高擬體外細胞外基質附 著鎖定目標PDB-MSCs貼附培養，利用優選的培養基組合，梯度無血清馴化培養體系獲得臨 床治療級別的H)B-MSC S-種科學快速有效獲取創新方法。本發明獲得干細胞國際細胞協會 (ISCT)標準具有高純度、干細胞增殖擴增、傳代活性強、以及凍存保護細胞活性技術，該技 術應用是干細胞治療領域核心基礎，滿足了TOB-MSCs干細胞臨床藥物設計開發與醫療機構 開展干細胞療法回輸安全有效應用的需求。
【背景技術】
[0002] 近年來，國際國內對干細胞再生醫學研究領域越來越重視，細胞治療再生醫學得 到了前所未有推進，科研領域沐浴在時代的朝陽下得以蓬勃發展。尤其是間充質干細胞已 經成為一種新的治療手段廣泛應用修復受損或病變的組織器官，治療心、腦血管疾病、神經 系統疾病、臨床骨修復、軟骨修復、骨髓再生、肌肉再生、脂肪形成、肌腱修復、基因治療、血 管支持、角膜損傷、燒傷燙傷創面修復等多種疾病。經過體外培養擴增后的干細胞在組織工 程再生和多種組織修復中展示出令科研工作者印象深刻的治療廣泛性潛能，這種潛能是科 研領域毋庸置疑的發展方向。
[0003] 間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells MSCs)具有自我更新和多向分化的能 力。來源于胚胎發育早期中胚層的一類多能干細胞。是一種非血源性的多功能干細胞，廣泛 存在于人體不同組織中，如骨髓、脂肪、牙周膜及臍帶，胎盤組織等。近幾年來有學者發現其 主要來源骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSc)可以自體移植， 避免了移植后的免疫排斥，骨髓間充質干細胞的體外擴增比較容易，而且具有跨系或跨胚 層分化為不同組織來源細胞的潛能，所以在臨床已經應用于中樞神經系統、心血管及免疫 系統等多系統疾病的治療，在癌癥和遺傳性疾病研究中也有涉及。BMSc可體外誘導分化為 成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌母細胞、并在一定的條件下誘導可分化為神經細胞，而且 可進行自體移植，避免免疫排斥，被認為是治療多種疾病的良好細胞來源。也有研究者認為 在胎盤組織中也含有豐富的間充質干細胞，提示可以將其提取作為干細胞移植治療的備選 細胞。胎盤間充質干細胞具有采集方便、易于體外培養、擴增和誘導等特性，被認為是干細 胞研究的一種理想種子細胞。
[0004] 骨髓間充質干細胞，在美國Π )Α已批準在心肌干細胞移植方面進入一期臨床試驗， 這充分展示了 MSCs的巨大應用前景。不過骨髓間充質干細胞在骨髓中的含量較少，而且隨 著年齡的增加，在骨髓中的含量逐漸減少，其增殖分化能力也逐漸減弱；同時骨髓間充質干 細胞的取材是有創侵入性操作，增加了捐獻者的痛苦和感染的機會，所以骨髓間充質干細 胞的臨床應用受到了一定的限制，并且病患嚴重感染、骨髓惡性腫瘤或隨著年齡的增長，骨 髓細胞數及增殖、分化能力均明顯下降等情況下，患者就無法順利獲得足量可用于治療的 BMSCs，為此很有必要尋找新的MSCs來源。
[0005] 再生組織工程細胞建立工作始于本世紀(Harrison 1907，Carrel 1912)，指導引 領著生物學，臨床醫學材料等各大銜接領域，被稱為重要的基礎科學之一，組織構建和細胞 體外培養是至關重要的課題。從供體捐獻者活體取組織，模擬體內生理環境等系列特定體 外微環境體系，進行孵化培養、使得組織細胞健康生長。間充質干細胞對細胞外基質的黏附 強快速特性，使得體外篩選培養人來源的間充質干細胞得以在國內外方法特異性發展。而 干細胞生物學性能，可以做到增進功能，避免潛在有害基因對干細胞控制分化時間與控制 不同分化方向等的影響，在基礎科研、臨床治療、干細胞治療研究方向、再生損傷修復等均 有歷史時期的重要不可取代的指導意義。
[0006] 細胞外基質(extracellular matrix,ECM)廣泛存在于細胞間隙的基本填充成分， 是細胞新陳代謝、生長、繁殖、分化、表達、傳遞、互惠所依賴的極其重要場所。早期研究學者 認為，外基質只是一種組織內、細胞外的單純的支持結構。Hauschka和Konigsberg在1966年 研究發現填充組織間隙的膠原與促進成肌細胞轉化肌管的現象，并在兩年之后得以證明， 學者們才對這種穩定外物質微環境有了新的認識和思考。
[0007] Hay在11年后報道了 ECM對胚胎發育過程具有重要的誘導作用。ECM影響細胞行為 的現象得以關注并進行廣泛的研究，但是并沒有成型的理論基礎來佐證ECM與細胞的密切 關系。直到1982年有學者提出證明并建立ECM與細胞骨架和核基質之間"動態互惠"的模型。 在這個模中，ECM分子與細胞表面受體互相作用，然后把信號通過細胞膜傳導進入細胞漿 中，引起從細胞骨架到細胞核的一系列變化，從而引起某些特定基因的表達。
[0008] 研究并證明這些基因的表達產物又可以反過來對ECM發生作用，今天的許多研究 證實了這個模型的合理性，并且證明細胞和ECM相互作用，直接參與了細胞的黏附、生長、游 走、分化和程序性死(凋亡）的過程。外介質參與調節細胞因子、生長因子的活性、還能夠直 接激活、啟動細胞內信號傳導機制。由于這種對細胞的調節和對信號的傳導作用，因此，我 們必須充分了解細胞外基質的化學、物理、生物學性質和功能及其在組織的形成和修復中 的作用，才能更好地應用這些生物材料構建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的"生物 構架"。我們建立的高擬細胞外基質材料利用的恰是反向理論，指導我們深入開展對ECM的 認識，同時也反作用得到我們可利用的干細胞，這種研究模式促進學科前行及發展。
[0009] 胎盤起源于胚胎發育期胚外中胚層，由間質、血管、滋養細胞組成，含有大量的間 充質成分，也含有大量的干細胞。臍血和臍帶華通氏膠中都可能含有MSCs，而與臍帶組織緊 密相連，在胎兒出生后多作為廢物與臍帶一起被丟棄的胎盤也含有與骨髓間充質干細胞相 似特性的細胞，胎盤組織中確含有這些前體細胞，極大程度上解決了干細胞的來源問題。
[0010] 足月胎盤是分娩的廢棄物，取材容易，對供者不造成損傷，無倫理問題，而且胎盤 體積大，獲得干細胞數量相對較多，所以胎盤間充質干細胞更方便適用于臨床。有學者在胎 兒蛻膜側胎盤組織成功分離培養出胎盤間充質干細胞，并觀察其生物學特性和抗凋亡細胞 因子血管內皮細胞生長因子、胰島素樣生長因子、肝細胞生長因子的分泌水平，結果證實胎 盤間充質干細胞的生物學特性與骨髓間充質干細胞相似，并能分泌血管內皮細胞生長因 子、胰島素樣生長因子和肝細胞生長因子。已有研究證實胎盤間充質干細胞具有與骨髓間 充質干細胞類似的功能和特性，兩者的多向分化潛能也類似，且胎盤來源的間充質干細胞 的增殖能力更強。國內外很多研究者發現，胎盤來源間充質干細胞在體外實驗中可被誘導 分化為中胚層的心肌細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞，內胚層的胰島細胞、肝細胞以 及外胚層的神經元、星形膠質細胞，軟骨細胞;而且這些結果同樣在心肌梗死和帕金森大鼠 模型、糖尿病小鼠模型和脊髓損傷靈長類動物模型等體內模型中治療顯效得到了證實。也 有報道稱胎盤來源間充質干細胞將進一步應用于修復人膝關節退行性改變或膝關節半月 板損傷科研實驗。
[0011]間充質干細胞是目前組織工程的主要種子細胞。經歷了多年多位學者的研究后， 雖然組織工程已經獲得了很大進展，然而目前缺乏理想篩選方法，間充質干細胞不易獲取、 體外擴增困難等限制，使其在臨床級別回輸的應用受到限制。因此，尋找一種易于獲得、免 疫原性低、易于體外擴增的臨床治療級別的種子細胞是目前組織工程迫切需要解決的問題 之一。
[0012] 本發明嘗試直接從胎盤組織中分離間充質干細胞，底蛻膜來源的間充質干細胞的 發明專利，并對所得細胞的生物學特性進行鑒定，為研究間充質干細胞分化能力，將其作為 種子細胞開展臨床應用研究提供獨特的思路獲取體系依據。為間充質干細胞臨床治療以及 基礎研究奠定科研基礎。
[0013] 人胎盤底銳膜間充質干細胞(placental decidua basalis-mesenchymal stem CellS，PDB-MSCs)來源豐富、獲取無創性、體外增殖能力強且不受低血清和低氧影響、具備 中胚層分化能力，公認是一種在體內具有無限更新能力，體外培養具有長期生長潛能并可 形成克隆。PDB-MSCs不存在倫理學限制是再生醫學干細胞移植治療潛在來源的重要種子細 胞。但由于目前缺乏理想篩選方法，對PDB-MSCs進行篩選培養及鑒定方法報道較少。PDB-MSCs與骨髓間充質干細胞相比，具有來源充足、免疫原性低、病毒污染率較低，且無社會倫 理爭議等方面的優點，使其具有更好的臨床應用前景。
[0014] 最常規的一種培養MSC干細胞的培養基就是添加有動物血清的培養基。然而，采用 這種培養基培養的MSC干細胞，不僅因添加量問題出現生長過快或比較緩慢現象，超過幾代 之后其分化成功能細胞的潛能大大降低，動物血清培養技術綜合增殖能力、免疫調節能力、 分泌細胞因子的能力這三方面均會受到不可控方向變化。國外不同地域廠商來源的動物源 血清批次存在潛在的不重復性，也是影響了其細胞擴增規模化生產的技術瓶頸;另一方面， 相對于人是異源性，異種蛋白混入潛在細胞治療不確定性，從而限制了其在臨床上的應用。 因此，探索快速擴增H)B-MSC S而又不影響其潛能的培養條件及其培養基組成的優化組合是 非常重要的研究內容。多組合培養體系仿生H)B-MSCs細胞體內環境的無血清培養方案與傳 統的含動物血清培養基相比，本發明提供取得TOB-MSCs純度高、貼壁性能強、獲取細胞能夠 保持干細胞幼稚形態、具有更好的細胞增殖速率和細胞干性，培養獲得的細胞表現出優異 的細胞性能同時降低了培養成本，符合臨床細胞治療安全性需求。
[0015] 參考文獻
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