一種無胎牛血清擴增激活lak細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫學領域，具體是指使用轉染了多種蛋白質的宿主細胞，聯合多種蛋白共同作用定向擴增激活LAK細胞的方法。
【背景技術】
[0002]LAK細胞為淋巴因子激活產生的一類細胞群，包括CIK、NK、NKT、T等細胞。LAK細胞治療對多種腫瘤，例如:肺癌、頭部和頸部鱗狀細胞癌、肉瘤癌和急性白血病等腫瘤治療有明顯療效。目前LAK細胞治療主要用來和手術、化療和放療聯合使用解決腫瘤的復發問題。LAK細胞數量和殺傷功能與療效直接相關，治療中存在的問題在于獲得高純度和足夠數量的CIK細胞和NK細胞非常困難。傳統使用的無血清培養基擴增的LAK細胞純度低(20%-30%);擴增后的CIK細胞殺傷功能低下，不能滿足臨床需求。采用胎牛血清培養的細胞雖然純度和數量上能夠滿足臨床的需求，但是因為胎牛血清可能含有牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)、瘋牛病朊病毒(BSE)、口蹄疫(FMD)和抗生素污染等原因，采用無血清培養基的工藝已經逐步在業界達成共識。本發明人之前的發明采用轉染0)8€[-白介素21工014、0)19工086、0)163和0)1371^蛋白質的1(562細胞(以下簡稱宿主細胞)用于擴增NK細胞。本發明將宿主細胞結合傳統使用的無血清工藝定向擴增激活CIK細胞和NK細胞，解決了無血清工藝數量和純度低的問題，同時避免了采用胎牛血清給患者帶來潛在威脅的問題。
【發明內容】
[0003]本發明針對現有無血清培養免疫細胞技術中的不足，提出一種更加有效的方法，實現LAK細胞的擴增。
[0004]本發明是通過下述技術方案得以實現的:一種無胎牛血清擴增激活LAK淋巴細胞的方法，使用轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞，聯合一種或多種蛋白質共同對淋巴細胞進行擴增激活，得到LAK淋巴細胞;所述蛋白質A包含CD8a的功能片段和白介素21的功能片段;蛋白質B包含CD14的功能片段;蛋白質C包含CD19的功能片段；蛋白質D包含CD86的功能片段;蛋白質E包含CD163的功能片段;蛋白質F包含⑶137L的功能片段。
[0005]進一步地，所述LAK淋巴細胞為CIK淋巴細胞，聯合的蛋白質包括蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl，所述蛋白質Al包含白介素2的功能片段、蛋白質BI包含IL-1a的功能片段、蛋白質Cl包含IFN-γ的功能片段、蛋白質Dl包含⑶3mAb的功能片段;所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、CIK細胞中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、CIK細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為白介素21、CD14、〇019、0)86丄0163丄01371^、白介素2、11^-1€[、1?1丫丄0311^中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的CIK淋巴細胞。
[0006]進一步地，所述方法包括以下步驟:
[0007](I)對轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞進行致死處理;所述致死處理選自強酸、強堿、輻照(劑量為100Gy-1000Gy)。
[0008](2)在含有淋巴細胞的培養液中，加入步驟I處理后的宿主細胞、以及蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl共同培養7天;使得所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的量均為50pM-1000pM。蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl的量均為10-1000IU/毫升，蛋白質Dl的量在10-1000納克/毫升;所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞= 1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4:1，最優選地為1:1。
[0009 ] (3)將培養后的培養液離心，獲取LAK淋巴細胞沉淀，并用培養液重懸；
[0010](4)加入輻照處理后的宿主細胞，使得宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10: I，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4: I，最優選地為I: I培養7天;將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，即得到LAK淋巴細胞；
[0011 ]其中，所述培養液由由100體積的GT-T551和10體積的人血清組成。
[0012]進一步地，所述LAK淋巴細胞為NK細胞;聯合的蛋白質為蛋白質Al，蛋白質Al包含白介素2的功能片段。所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、NK細胞中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、NK細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶163、⑶137L、白介素2中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的NK淋巴細胞。
[0013]進一步地，所述方法包括以下步驟:
[0014](I)對轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞進行致死處理;所述致死處理選自強酸、強堿、輻照(劑量為100Gy-1000Gy)。
[0015](2)在含有淋巴細胞的培養液中，加入步驟I處理后的宿主細胞、以及蛋白質Al共同培養7天;使得所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的量均為50pM-1000pM。蛋白質Al的量為10-1000IU/毫升，所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4:1，最優選地為 1:1。
[0016](3)將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，并用培養液重懸；
[0017](4)加入輻照處理后的宿主細胞，使得宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10: I，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4: I，最優選地為I: I培養7天;培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，即得到NK淋巴細胞；
[0018]其中，所述培養液由100體積的GT-T551和I體積的人血清組成。
[0019]進一步地，所述宿主細胞為K562細胞。
[0020]進一步地，所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F為純化的蛋白質或由宿主細胞在細胞膜表面即時表達，蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl均為純化的蛋白質;所述純化是指質量分數在90%以上。
[0021 ]進一步地，所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F分別為CD8α_白介素21復合物、CD14、CD19、CD86、CD163和CD137L，其中，CD8a為在宿主細胞膜上表達的膜蛋白，⑶8a連接白介素21后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；CD14、⑶19、⑶86和⑶137均為膜蛋白。
[0022]進一步地，轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞通過蛋白穩定表達系統得到。
[0023]一種LAK淋巴細胞的應用，所述應用為，將LAK淋巴細胞用于制備治療癌癥、傳染性疾病、糖尿病、或器官移植的藥物。
[0024]本發明的有益效果:
[0025](1)本發明在1(562細胞上，轉染了008€[-白介素21、001371^、0)14、0019、0)86、⑶163。1(562細胞上轉染的⑶14、CD86、⑶163有助于激活LAK細胞識別并殺傷微環境中M2類型的腫瘤相關巨噬細胞;轉染CD19有助于激活LAK細胞識別并殺傷B細胞。
[0026](2)本發明提供體外擴增和激活CIK細胞的方法比未加宿主細胞的方法，擴增的數量提高2.1倍;擴增后PBMC中的CIK細胞的純度從3.5%提高到75.6%。動物實驗結果表明:與用未加宿主細胞擴增的CIK細胞相比，采用本發明擴增的CIK細胞顯著提高了對小鼠體內腫瘤的殺傷能力。
[0027](3)本發明提供體外擴增和激活NK細胞的方法比未加宿主細胞的方法，擴增的數量提高2.2倍;擴增后PBMC中的NK細胞的純度從5.5%提高到90.5%。動物實驗結果表明:與用傳統的方案擴增的NK細胞相比，采用本發明擴增的NK細胞顯著提高了對小鼠體內腫瘤的殺傷能力。
[0028](4)本發明通過宿主細胞、白介素2、IL-1a、IFN- γ、CD3mAb等培養擴增激活的CIK和NK細胞提高病人的免疫力來幫助病人抵抗腫瘤，抵抗病毒和細菌。
【附圖說明】
[0029]圖1.?811(:中(:11(和爾細胞體外擴增線性圖(^.(:11(細胞在宿主細胞、11^1€[、正1丫、CD3mAb和白介素2共同作用下線性增長(培養液為1%人血清，標記為GT551H3+宿主細胞)。IL-1a、IFN- γ、CD3mAb和白介素2擴增PBMC中的CIK細胞作為對照(培養液為I %人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增CIK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清hB.NK淋巴細胞在宿主細胞和白介素2共同作用下線性增長。白介素2擴增NK細胞作為對照；胎牛血清擴增NK細胞作為對照。
[0030]圖2.PBMC中CIK細胞體外擴增流式細胞儀數據圖。PBMC細胞在宿主細胞、IL-la、IFN-γ、CD3mA