2通氣 量為5%，溶氧量為50%，pH為7.2,攪拌速度為45rpm的條件繼續培養至兩周，培養基為含有 IL-2、IL-15 分別 1 ~10U/ml 的 X-VIVO 15 培養基。
[0031 ] 所述IL-15溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。優選地，所述IL-15溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶液的濃度 為300U/ml，0KT-3溶液的濃度為500U/ml。
[0032] 整個培養過程中觀察并記錄細胞生長情況，每2~3天進行細胞計數并補充適量的 培養基、IL-15和IL-2,培養體系中IL-2、IL-15的濃度均為1~10U/ml。
[0033] 對比例1
[0034] 取2X 106個種子NK細胞，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培養基接種于 T75培養瓶中，并添加 IL-15溶液、IL-2溶液和0KT-3溶液，IL-15溶液、IL-2溶液和0KT-3溶液 的用量分別為培養基體積的1%，在37°C、5%C02條件下培養，根據細胞的擴增情況，進行分 瓶培養，當培養體系總量大于500ml時，將其轉入2L培養中繼續培養至兩周，培養條件與實 施例1相同。
[0035] 所述IL-15溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。優選地，所述IL-15溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶液的濃度 為300U/ml，0KT-3溶液的濃度為500U/ml。
[0036] 整個培養過程中觀察并記錄細胞生長情況，每2~3天進行細胞計數并補充適量的 培養基、IL-15和IL-2,使細胞密度為lX10 6cellS/ml，培養體系中IL-2、IL-15的濃度均為1 ~10U/ml〇
[0037] 對比例2
[0038] 取2X 106個種子NK細胞，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培養基接種于 T75培養瓶中，并添加 IL-15溶液、IL-2溶液和0KT-3溶液，IL-15溶液、IL-2溶液和0KT-3溶液 的用量分別為培養基體積的1%，在37°C、5%C02條件下培養。根據細胞的擴增情況，進行分 瓶培養，當培養體系總量大于200ml時，則進行分瓶培養，每瓶培養體積不超過200ml，培養 至兩周。
[0039] 所述IL-15溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。優選地，所述IL-15溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶液的濃度 為300U/ml，0KT-3溶液的濃度為500U/ml。
[0040] 整個培養過程中觀察并記錄細胞生長情況，每2~3天進行細胞計數并補充適量的 培養基、IL-15和IL-2,使細胞密度為lX10 6cellS/ml，培養體系中IL-2、IL-15的濃度均為1 ~10U/ml〇
[0041] 效果實施例1
[0042]在各實施例、對比例培養結束后收集NK細胞，采用臺盼藍染色法進行細胞計數，計 算細胞的擴增倍數，結果如表1所示。
[0043] 表1、NK細胞擴增倍數、活力、培養體積以及細胞密度表
[0044]
[0045]由表1可知，使用實施例1方法培養NK細胞，擴增倍數高達412倍，是對比例1擴增倍 數的2倍多，是對比例2擴增倍數的近4倍。所以，使用本發明方法培養NK細胞可以大大提高 NK細胞的擴增倍數、細胞密度大，而且保持較高的細胞活力。
[0046]效果實施例2
[0047]在各實施例、對比例培養結束后收集NK細胞，采用常規方法進行流式檢測，考察NK 細胞的表面抗原CD3、CD56的表達情況，結果如表2所示。
[0048] 表2、CD3-CD56+表達量表
[0049]
[0050]由表2可知，使用實施例1方法培養得到的NK細胞，其CD3-CD56+表達量為99.7%，而 使用對比例1方法培養得到的NK細胞的⑶3TD56+表達量為96.2%，用對比例2方法培養得到 的NK細胞的CD3-CD56+表達量為92.4%.所以，本發明方法培養得到的服細胞的表面抗原表 達量較高。
[0051 ]效果實施例3
[0052]在各實施例、對比例培養結束后收集NK細胞，采用乳酸脫氫酶釋放法進行其對 K562細胞的殺傷活性檢測，結果如表3和圖1所示。
[0053] 表3、NK細胞殺傷活性表
[0054]
[0055]
[0056] 由表3和圖1可知，本發明方法培養得到的NK細胞對K562細胞的殺傷活性較高。
[0057] 以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種使用生物反應器培養NK細胞的方法，其特征在于，攪拌槳外包裹有減小剪切力 的材料。2. 根據權利要求1所述的使用生物反應器培養NK細胞的方法，其特征在于，包括以下步 驟： 用X-VIVO 15培養基將種子NK細胞按照1 X 106cells/ml的密度接種于培養瓶中，分別添 加1 %培養基體積的IL-15溶液、IL-2溶液和0KT-3溶液，在37 °C、5 % C02條件下培養，當培養 體系達到一定體積后，轉入生物反應器中繼續培養至兩周，每2~3天補充適量的培養基、 IL-2和IL-15; 所述IL-15溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3溶 液的濃度為500~2000U/ml。3. 根據權利要求2所述的使用生物反應器培養NK細胞的方法，其特征在于，所述減小剪 切力的材料為醫用硅膠管或食用橡膠管。4. 根據權利要求2所述的使用生物反應器培養NK細胞的方法，其特征在于，所述IL-15 溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶液的濃度為300U/ml，OKT-3溶液的濃度為500U/ml。5. 根據權利要求2所述的使用生物反應器培養NK細胞的方法，其特征在于，當培養體系 大于500ml時，轉入2L生物反應器中繼續培養。6. 根據權利要求2所述的使用生物反應器培養NK細胞的方法，其特征在于，在生物反應 器中培養NK細胞的條件為:溶氧量為50%，pH7.2，攪拌速度為45rpm。7. -種生物反應器攪拌槳，其特征在于，所述攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。8. 根據權利要求7所述的生物反應器攪拌槳，其特征在于，所述減小剪切力的材料為醫 用硅膠管或食用橡膠管。9. 一種生物反應器，其特征在于，所述生物反應器的攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。10. 根據權利要求9所述的使用生物反應器，其特征在于，所述減小剪切力的材料為醫 用硅膠管或食用橡膠管。
【專利摘要】本發明公開了一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培養NK細胞的方法。所述攪拌槳外包裹有減小剪切力的材料，所述生物反應器含有其外包裹減小剪切力材料的攪拌槳，使用該生物反應器培養NK細胞。本發明使用生物反應器培養NK細胞，在攪拌槳外包裹可以減小剪切力的材料，可以降低細胞受到的剪切力傷害，有利于細胞大量擴增。本發明培養過程中不停的攪拌，為動態系統，有利于細胞進行氣體交換和為細胞提供均一的培養環境，有利于細胞大量擴增。本發明方法不僅可以大量擴增NK細胞，而且所得NK細胞表面抗原表達量較高，對腫瘤細胞的殺傷活性較強。
【IPC分類】C12M3/00, C12N5/0783, C12M1/02
【公開號】CN105647862
【申請號】
【發明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 曾維杰
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月11日