Dc誘導活化劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及組織工程領域，特別涉及一種DC誘導活化劑及其應用。
【背景技術】
[0002] 細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，彌補了傳 統的手術、放療、化療的弊端，已經被公認為二十一世紀腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有 發展前途的一種治療手段，也是世界目前唯一有希望完全消滅腫瘤細胞的治療手段。
[0003] 細胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細胞，經過體外培養，使其數量成千倍增 多，靶向性殺傷功能增強，然后再回輸到人體來殺滅血液及組織中的病原體、癌細胞、突變 的細胞，打破免疫耐受，激活和增強機體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。目前在 臨床中使用最多的細胞免疫治療療法主要是DC治療、CIK治療和DC-CIK聯合免疫治療。
[0004] DC是目前發現的功能最強大的抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)。 近年來，以樹突狀細胞(dendritic cell，DC)為基礎的腫瘤免疫治療及DC疫苗已取得較大 進展，體外制備的DC疫苗顯示出明顯誘發抗腫瘤免疫應答的能力，具有良好的臨床應用前 景。目前，從外周血單個核細胞(PBMC)經GM-CSF、IL-4體外誘導培養DC的方法已基本得到公 認，但DC體外促成熟的方案尚沒有統一的標準，國內主要采用TNF-a因子，但該方法活化的 DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12,致使培養得到的DC功能缺陷，很大程度上限制了 DC疫苗的臨床應用工作的開展。因此，有必要對現有DC細胞培養方案進行進一步完善，以有 效提高DC疫苗在誘導抗炎或抗腫瘤免疫應答中的作用。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術培養出的樹突狀細胞體外誘導成熟 率低，細胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一種能夠提高樹突狀細胞成熟率及抗 原提呈性能的DC誘導劑及其在誘導DC成熟過程中的應用。
[0006] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種DC誘導活化劑，包括 rhTNF-α和，沒食子酸或核桃青皮提取物。
[0007] 在本發明提供的DC誘導活化劑中，所述rhTNF-a的濃度為800~1200U/ml和，沒食 子酸的濃度為5~15μg/ml或所述核桃青皮提取物的濃度為10~30μg/ml。
[0008] 在本發明提供的DC誘導活化劑中，所述rhTNF-a的濃度為1 〇〇〇U/ml和、沒食子酸的 濃度為l〇μg/ml或所述核桃青皮提取物的濃度為20μg/ml。
[0009] 在本發明提供的DC誘導活化劑中，所述rhTNF-a的濃度為800U/ml和、沒食子酸的 濃度為Sμg/ml或所述核桃青皮提取物的濃度為10μg/ml。
[0010]在本發明提供的DC誘導活化劑中，所述rhTNF-a的濃度為1200U/ml和、沒食子酸的 濃度為15μg/ml或所述核桃青皮提取物的濃度為30μg/ml。本發明進一步提供上述的DC誘導 劑在誘導DC成熟過程中的應用。
[0011]實施本發明提供的DC誘導活化劑及其應用，可以達到以下有益效果：與現有樹突 狀細胞誘導活化劑相比，本發明提供的DC誘導活化劑，能夠促進提高樹突狀細胞的細胞活 性，提高樹突狀細胞的增值率及成熟率，進而提高樹突狀細胞的抗原提呈性。
【具體實施方式】
[0012]本發明提供的DC誘導活化劑，包括rhTNF-α(Recombinant human tumor necrosis factor-α，重組人腫瘤壞死因子a)和沒食子酸；其中，沒食子酸可由核桃青皮提取物來代 替。
[0013]進一步地，rhTNF-α能夠刺激樹突狀細胞成熟，以提高樹突狀細胞抗原提呈能力； 優選地，rhTNF-a的濃度為800~1200U/ml。而核桃青皮提取物的主要成份包括沒食子酸、甲 醇、石油醚、氯仿、正丁醇等，核桃青皮提取物和沒食子酸對金黃色葡萄球菌等細菌均具有 強抗菌作用，并且對真菌也有明顯抑制作用；另外，還能夠清除自由基，具有較強的抗氧化 活性，以提高樹突狀細胞的細胞活性，促進其成熟和正常的生長增殖。優選地，沒食子酸的 濃度為l〇μg/ml，或核桃青皮提取物的濃度為10~30μg/ml。
[0014] 本發明提供的DC誘導活化劑，應用于DC成熟過程的方法，包括以下步驟：
[0015] S1、獲取樹突狀細胞前體單個核細胞；
[0016] S2、采用第一誘導劑將樹突狀前體細胞當個核細胞誘導分化成未成熟樹突狀細 胞；
[0017] S3、采用第二誘導劑將未成熟樹突狀細胞誘導分化成成熟的樹突狀細胞;其中，第 二誘導劑為本發明提供的DC誘導活化劑。
[0018] 具體地，步驟S1中，優選地，樹突狀細胞前體單個核細胞來源于新鮮外周血，相比 經過冷庫儲存或者培養傳代之后的樹突狀細胞，從新鮮血液中制備的樹突狀細胞前體單個 核細胞離體時間較短，其細胞活性和狀態的減弱或者形態改變程度都較少，更加利于保持 其免疫性能。在本發明中，樹突狀細胞前體單個核細胞的具體獲取過程為：
[0019] 抽取外周靜脈血，稀釋，添加淋巴細胞分離液離心10~20分鐘后，分離獲取外周血 單個核細胞；
[0020] 用含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml鏈霉素的完全 培養基懸浮細胞濃度至(2~6) X106個/ml，孵育1~3小時，更換新的完全培養基，收集細胞 懸液，即為樹突狀細胞前體單個核細胞懸液。
[0021] 步驟S2的具體過程為：
[0022] 取步驟S1獲得的樹突狀細胞前體單個核細胞懸液，離心洗滌后計數，使細胞濃度 達到（1~3) X106個/ml，用完全培養基培養，并與培養當天添加第一誘導劑，培養4~7天， 每隔2~3天更換培養基。
[0023] 其中，第一誘導劑包括rhGM_CSF(Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，重組人粒-巨細胞集落刺激因子）、GM_CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，粒-巨細胞集落刺激因子）、IL_4( Interleukin 4,白細胞介素4)、rhIL_4(Recombinant human interleukin 4,重組人白細胞介素4)和IL-13(Interleukin 13,白細胞介素 13);其中，rhGM-CSF的終濃度為800~1200U/ml、GM-CSF的 終濃度為5~15ng/mL、IL-4的終濃度為5~15ng/mL、rhIL-4的終濃度為800~1200U/ml和 IL-13的終濃度為IL-13的濃度為5~15ng/mL。
[0024] 第一誘導劑所含成分能夠誘導樹突狀細胞前體單個核細胞轉化為未成熟的樹突 狀細胞，增大細胞體積，并促進細胞的生長增殖和分化，促進細胞形成集落；同時，對已分化 的未成熟樹突狀細胞進行預刺激，使未成熟樹突狀細胞能夠快速成熟。
[0025] 步驟S3的具體過程為：
[0026] 向步驟S2a獲得的未成熟樹突狀細胞中添加第二誘導劑培養2~4天至未成熟的樹 突狀細胞全部成熟;其中，第二誘導劑包括rhTNF-α、沒食子酸或核桃青皮提取物;且rhTNF-a的終濃度為800~1200U/ml、沒食子酸的終濃度為5~15μg/ml或核桃青皮提取物的終濃度 為核桃青皮提取物的濃度為10~3〇μg/ml。
[0027]其中，rhTNF-a能夠刺激樹突狀細胞成熟，以提高樹突狀細胞抗原提呈能力。而核 桃青皮提取物的主要成份包括沒食子酸、甲醇、石油醚、氯仿、正丁醇等，對金黃色葡萄球菌 等細菌具有強抗菌作用，并且對真菌也有明顯抑制作用；另外，還能夠清除自由基，具有較 強的抗氧化活性，以提高樹突狀細胞的細胞活性，促進其成熟和正常的生長增殖。
[0028] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限 定本發明。
[0029] 實施例1
[0030] 本發明提供的DC誘導活化劑在誘導DC成熟的方法中的應用，包括以下步驟：
[0031] Sla、獲取樹突狀細胞前體單個核細胞；
[0032]抽取外周靜脈血3-5ml，生理鹽