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同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞dc-cik、nk的方法及制得的聯合免疫細胞的制作方法

文檔序號:9882182閱讀:984來源:國知局
同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞dc-cik、nk的方法及制得的聯合免疫細胞的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞的方法,尤其是一種以外周血或者臍血作為原材料,配合美天旎公司生產的TexMACS免疫細胞培養基,配合自體血清及多種細胞因子成分,獲得抗腫瘤的聯合免疫細胞DC_CIK、NK。
技術背景
[0002]腫瘤的免疫細胞療法作為腫瘤的第四種治療手段,因其安全、有效且無副作用的特點正逐漸被醫學界所認同,并被作為人類最終能夠徹底戰勝腫瘤的利器而大力發展。目前,臨床上常用的免疫細胞療法包括DC(Dendritic cell)細胞、CIK(Cytokine inducedkiller)細胞、NK(Natural killer)細胞等。但是,這幾種細胞都存在其確定及臨床局限性,無法對各種腫瘤細胞進行高效的殺傷。

【發明內容】

[0003]本發明所要解決的問題是,提供一種通過少量的外周血或者臍血獲得自體血清及夕卜周血單個核細胞(PBMC)最終同時制備出滿足臨床治療標準的抗腫瘤的聯合免疫細胞DC-CIK、NK0
[0004]為了解決上述技術問題,本發明采用的技術方案是:一種同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞DC-CIK、NK的方法,以外周血或者臍帶血為原材料,通過Ficoll密度梯度離心法分離獲得PBMC和上層血漿,上層血漿采用滅活并凍融的方法獲得自體血清,自體血清配合免疫細胞培養基及多種細胞因子,將分離的PBMC分別誘導DC、CIK及NK,CIK細胞每隔2天擴大培養、NK細胞每隔3天擴大培養,最終保證能夠在14-17天同時達到數量要求,在CIK細胞誘導中,在第7天加入CD28、CD3單抗提高CIK的擴增效率,在NK細胞擴增中,在第I天及第7天使用CD16單抗進行2次刺激的方法提高NK的擴增效率。
[0005]具體地說,包括以下步驟:
[0006]I)采集人體的外周血或者臍帶血,通過Ficoll密度梯度離心法分離獲得PBMC和上層血漿,上層血漿通過滅活、凍融、高速離心、過濾的流程從中制備出自體血清;
[0007]2)配置細胞誘導培養基備用
[0008]DC細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度5-10%的步驟I)中制備的自體血清、80-150 IU/ml 的 IL-4 和800-1500 IU/ml 的 GM-CSF ;
[0009]CIK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有有體積濃度5-10 %的步驟I)中制備的自體血清和300-1000IU/ml的IL-2;
[0010]NK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度5-10%的步驟I)中制備的自體血清、300-1000IU/ml 的 IL-2、20_200ng/ml 的 IL-12、50_200ng/ml 的 IL-15 ;
[0011]3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養瓶中,加入40-50ml免疫細胞培養基、并加入步驟I)中制備的2-4ml的自體血清,孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出,貼壁的細胞中加入40-50ml DC細胞誘導培養基,誘導DC細胞;
[0012]4)將步驟3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的PBMC中,按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前4-12小時預包被4-10ug的⑶3McAb的T-175細胞培養瓶,以及預包被20-40ug的CD16McAb的T-175細胞培養瓶中;在預包被CD3McAb的培養瓶中加入100ml CIK細胞誘導培養基和終濃度500-1000IU/ml的IFN-r,誘導CIK細胞;在預包被CD16McAb的培養瓶中加入100ml NK細胞誘導培養基以及終濃度500-1000IU/ml的IFN_r,誘導NK細胞;
[0013]4)培養第3天,在CIK細胞誘導體系中補加5-10ml的自體血清、30000-100000IU的IL-2繼續培養;
[0014]5)培養第4天,在DC細胞誘導體系中加入30-40ml DC細胞誘導培養基,混合均勻后培養;同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養基,混合均勻后繼續培養;
[0015]6)培養第5天,在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基,混合均勻后繼續培養;
[0016]7)培養第6天,在DC細胞誘導體系中按照終濃度500-1000IU/ml加入TNF-a,混合均勻后繼續培養;
[0017]8)第7天,將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液加入到一個1.8升容量的細胞培養袋中并在培養體系中加入200ml CIK細胞誘導培養基并加入4-10ug的⑶3McAb以及15-30ug的CD28McAb;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養袋中與CIK細胞共培養;同時,將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養袋中,并在培養體系中并加入400ml的NK細胞誘導培養基以及20-40ug的⑶16McAb,混合均勻后繼續培養;
[0018]9)第9天,在DC+CIK細胞共培養的培養袋中加入400mlCIK細胞誘導培養基,混合均勻后繼續培養;
[0019]10)第11天在DC+CIK細胞共培養的培養袋中加入800ml CIK細胞誘導培養基,混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞的培養袋中加入100ml的NK細胞誘導培養基,混合均勻后繼續培養;
[0020]11)第14天取出800-1000ml的DC+CIK細胞共培養的培養袋中細胞懸液收獲細胞,并加入400-600ml的CIK細胞誘導培養基,混合均勻后繼續培養;與此同時取出800-1000ml的NK細胞的培養袋中細胞懸液收獲細胞,加入400-600ml的NK細胞誘導培養基,混合均勻后繼續培養;
[0021]12)第17天,將DC+CIK細胞共培養的培養袋及NK細胞的培養袋中的所有細胞收獲。
[0022]所述免疫細胞培養基為美天旎公司生產的TexMACS免疫細胞培養基。
[0023]將獲得的血漿在56°C的條件下滅活30-35min后,通過-20°C完全凍結,在20-24°C融化后,通過10000-12000rpm的條件下離心5-10min,使用0.4um的濾膜過濾上清后獲得自體血清。
[0024]上述的制備方法制得的聯合免疫細胞。
[0025]本發明的有益效果是:本發明將分離PBMC過程中獲得的自體血漿作為原料,利用簡單快捷的方法制備出自體血清,配合多種細胞因子及聯合培養技術對DC、CIK及NK分別進行誘導培養并在一定時間點將細胞混合培養及應用,避免了胎牛血清的應用,減少外源致熱源、致敏源污染幾率,同時增強了最終混合細胞的腫瘤殺傷活性;利用細胞培養袋技術、減少細胞污染幾率,適合臨床治療應用。
【附圖說明】
[0026]圖1培養第7天的CIK、NK、DC細胞圖。
[0027]圖2培養第7天的DC細胞的流式檢測結果圖(成熟DC細胞的表面標志物CD1A、CD83、CD86的陽性率分別為75 %、79 %、89 % )。
[0028]圖3誘導第17天CIK及NK細胞誘導結果圖(在各自的培養體系中CIK細胞的比例為27.2% ;NK細胞的比例為55.3%)。
【具體實施方式】
[0029]本發明同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞DC_CIK、NK的方法,以外周血或者臍帶血為原材料,通過Ficoll密度梯度離心法分離獲得PBMC和上層血漿,上層血漿采用滅活并凍融的方法獲得自體血清,自體血清配合免疫細胞培養基及多種細胞因子,將分離的PBMC分別誘導DC、CIK及NK,CIK細胞每隔2天擴大培養、NK細胞每隔3天擴大培養,最終保證能夠在14-17天同時達到數量要求,在CIK細胞誘導中,在第7天加入⑶28、⑶3單抗提高CIK的擴增效率,在NK細胞擴增中,在第I天及第7天使用CD16單抗進行2次刺激的方法提高NK的擴增效率。
[0030]具體地說,包括以下步驟:
[0031]I)采集人體的外周血或者臍帶血,通過Ficoll密度梯度離心法分離獲得PBMC和上層血漿,上層血漿通過滅活、凍融、高速離心、過濾的流
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