水1:1稀釋，然后沿管壁緩緩加入到3~5ml比重為 1 ·077±0 .OOlg/ml的Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液上，1500r/min離心15分鐘，分離獲取 外周血單個核細胞，用含10 %胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養基 (購自Gibco公司）懸浮細胞濃度為4X10 6/ml，移至六孔板中，2ml/孔，將六孔板放于37°C、 5 % C02培養箱中孵育2小時，去掉培養基及懸浮的細胞，在每孔中放入新鮮的RPMI1640培養 基，輕輕吹打，吹起壁上細胞，收集細胞懸液，即樹突狀細胞前體單個核細胞。
[0033] S2a、將樹突狀細胞前體單個核細胞誘導分化成未成熟樹突狀細胞；
[0034] 將步驟Sla中獲得的細胞懸液轉移到15ml離心管中，離心洗滌，計數細胞，使細胞 濃度達到2 X 106/ml，然后用完全培養基(含10 %胎牛血清RPMI1640)培養，并于培養當天加 入第一誘導劑，置于培養箱中培養6天，每隔3天更換新的培養基，并補充第一誘導劑，即可 收獲未成熟樹突狀細胞；
[0035] 其中，第一誘導劑中包括：1000U/ml的rhGM-CSF、10ng/mL的GM-CSF、10ng/mL的IL-4，1000U/ml的rhIL-4和10ng/mL的IL-13。
[0036] S3a、誘導未成熟樹突狀細胞成熟；
[0037] 在樹突狀細胞前體單個核細胞培養的第6天，加入第二誘導劑培養3天至樹突狀細 胞成熟；
[0038] 其中，第二誘導劑中包括：1000U/ml的rhTNF-a、l〇μg/ml的沒食子酸的濃度為，或 20^/πι1的核桃青皮提取物。
[0039] 實施例2
[0040] 與實施例1的不同之處在于，在本實施例中，
[0041] 所采用的第一誘導劑中，
[0042] rhGM-CSF 的濃度為800U/ml、
[0043] GM-CSF 的濃度為 5ng/mL、
[0044] IL-4 的濃度 5ng/mL、
[0045] rhIL-4 的濃度為800U/ml、
[0046] 和 IL-13 的濃度為 5ng/mL;
[0047] 第二誘導劑中，
[0048] rhTNF-α 的濃度為800U/ml、
[0049] 沒食子酸的濃度為5μg/ml，
[0050] 或核桃青皮提取物的濃度為l〇μg/ml。
[0051 ] 實施例3
[0052]與實施例1的不同之處在于，在本實施例中，
[0053]所采用的第一誘導劑中，
[0054] rhGM-CSF 的濃度為 1200U/ml、
[0055] GM-CSF 的濃度為 15ng/mL、
[0056] IL-4 的濃度 15ng/mL、
[0057] rhIL-4 的濃度為 1200U/ml、
[0058] 和 IL-13 的濃度為 15ng/mL;
[0059] 第二誘導劑中，
[0060] rhTNF-a 的濃度為 1200U/ml、
[0061 ]沒食子酸的濃度為15μg/ml，
[0062]或核桃青皮提取物的濃度為30μg/ml。
[0063]為進一步驗證本發明提供的DC誘導活化劑及其應用具有顯著的有益效果，設置以 下實驗進行驗證。
[0064] 檢測組1~3-分別對應本發明實施例1~3所提供的成熟的樹突狀細胞；
[0065] 對照組一為采用現有方法獲得的樹突狀細胞。
[0066] 1.細胞表型的FACS分析
[0067]分別收集檢測組和對照組4組樹突狀細胞，加入PBS溶液懸浮細胞，調整細胞濃度 至為IX 106/ml，取100μΙ加入離心管，然后分別加入熒光標記抗體(抗⑶86、⑶11b、⑶11c及 I-Ab單抗)調整終濃度為5μg/ml，置4°C冰箱中，避光反應15min，添加 roS溶液洗滌2遍，以熒 光標記的同型Ig作為對照，上機(FACS calibur)檢測細胞焚光強度，Cellquest軟件分析。
[0068] 采用流式細胞術檢測兩組樹突狀細胞免疫分子表型熒光強度的比較(x±s)，檢測 結果如下表1:
[0069] 表1 「00701
[0071] 檢測結果:CD86含量高于CDllc和la說明樹突狀細胞表面共刺激分子活化T細胞的 第二信號CD86高表達，由表1數據可知，經本發明提供的DC誘導活化劑誘導所獲得的成熟的 樹突狀細胞表面免疫分子活化T細胞的能力較強。
[0072] 2』1^六法測定細胞因子（幾-10和11^-12?70)的含量
[0073]分別收集檢測組1~3和對照組促成熟后的樹突狀細胞的上清液驚醒ELISA檢測， 檢測上清中IL-10與IL-12p70的分泌情況，檢測數據見下表2，IL-10與IL-12p70的分泌水平 (x±s)，（單位:pg/ml)
[0074] 表 2
[0075]
L〇〇76J 檢測結果：由表2數據扣知，檢測組1-3中，樹突狀細胞分泌的IL-12p70的水肀遠大 于IL-10,而IL-12p70能夠直接作用CD8+T細胞使其增殖，增強細胞免疫效應以及形成長久 記性T淋巴細胞，能夠分泌高水平的IL12是樹突狀細胞生物活性高的標志之一；由此可知， 通過本發明提供的DC誘導活化劑所獲得的樹突狀細胞生物活性優于對照組通過現有技術 所獲的樹突狀細胞的生物活性。
[0077] 3. CCK-8法抗原肽特異性T細胞的增殖反應
[0078] 分別對檢測組1~3和對照組細胞執行以下操作：
[0079] 將抗原肽負載并促成熟后的樹突狀細胞與T細胞以細胞數1:10的比率共培養5天 后，用CCK法檢測T細胞的增殖情況。
[0080] 表3為檢測組和對照組影響T細胞增殖反應的比較（％，x土s)
[0081]
[0082] 檢測結果:樹突狀細胞作為抗原呈遞細胞的一個重要的功能是刺激T細胞增殖，因 此，樹突狀細胞能否激活細胞毒性T淋巴細胞是檢驗樹突狀細胞功能的關鍵問題。由表3中 數據可知，通過本發明提供的DC誘導活化劑所獲得的樹突狀細胞能夠促進并提高T細胞的 增值率，增強免疫反應能力。
[0083] 以上對本發明的實施例進行了描述，但是本發明并不局限于上述的具體實施方 式，上述的【具體實施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領域的普通技術人員在本發 明的啟示下，在不脫離本發明宗旨和權利要求所保護的范圍情況下，還可做出很多形式，這 些均屬于本發明的保護之內。
【主權項】
1. 一種DC誘導活化劑，其特征在于，包括rhTNF-α和，沒食子酸或核桃青皮提取物。2. 根據權利要求1所述的DC誘導活化劑，其特征在于，所述rhTNF-α的濃度為800~ 1200U/ml和，沒食子酸的濃度為5~15μg/ml或所述核桃青皮提取物的濃度為10~30μg/ml。3. 根據權利要求2所述的DC誘導活化劑，其特征在于，所述rhTNF-a的濃度為l〇〇〇U/ml 和、沒食子酸的濃度為l〇μg/ml或所述核桃青皮提取物的濃度為20μg/ml。4. 根據權利要求2所述的DC誘導活化劑，其特征在于，所述rhTNF-a的濃度為800U/ml 和、沒食子酸的濃度為5μg/ml或所述核桃青皮提取物的濃度為10μg/ml。5. 根據權利要求2所述的DC誘導活化劑，其特征在于，所述rhTNF-a的濃度為1200U/ml 和、沒食子酸的濃度為15μg/ml或所述核桃青皮提取物的濃度為30μg/ml。6. 根據權利要求1~5任一項所述的DC誘導活化劑，在誘導DC成熟過程中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種DC誘導活化劑，包括rhTNF-α、沒食子酸或核桃青皮提取物。本發明進一步涉及由上述DC誘導活化劑在誘導DC成熟過程中的應用。與現有技術相比，本發明提供的DC誘導活化劑能夠提高樹突狀細胞的細胞活性，提高樹突狀細胞細胞的增值率及成熟率，進而提高樹突狀細胞的抗原提呈性。
【IPC分類】C12N5/0784
【公開號】CN105647866
【申請號】
【發明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫學科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月28日