U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養基 (購自Gibco公司）懸浮細胞濃度為4X10 6/ml，移至六孔板中，2ml/孔，將六孔板放于37°C、 5 % C02培養箱中孵育2小時，去掉培養基及懸浮的細胞，在每孔中放入新鮮的RPMI1640培養 基，輕輕吹打，吹起壁上細胞，收集細胞懸液，即樹突狀細胞前體單個核細胞。
[0042] S2a、將樹突狀細胞前體單個核細胞誘導分化成未成熟樹突狀細胞；
[0043] 將步驟Sla中獲得的細胞懸液轉移到15ml離心管中，離心洗滌，計數細胞，使細胞 濃度達到2 X 106/ml，然后用完全培養基(含10 %胎牛血清RPMI1640)培養，并于培養當天加 入第一誘導劑，置于培養箱中培養6天，每隔3天更換新的培養基，并補充第一誘導劑，即可 收獲未成熟樹突狀細胞；
[0044] 其中，第一誘導劑中包括：l〇〇〇U/ml的rhGM-CSF、10ng/mL的GM-CSF、10ng/mL的IL-4，1000U/ml的rhIL-4和10ng/mL的IL-13。
[0045] S3a、誘導未成熟樹突狀細胞成熟；
[0046] 在樹突狀細胞前體單個核細胞培養的第6天，加入第二誘導劑培養3天至樹突狀細 胞成熟；
[0047] 其中，第二誘導劑中包括：1000U/ml的rhTNF-α、lOμg/ml的沒食子酸的濃度為，或 20^/πι1的核桃青皮提取物。
[0048] 實施例2
[0049] 與實施例1的不同之處在于，在本實施例中，
[0050] 所采用的第一誘導劑中，
[0051 ] rhGM-CSF 的濃度為800U/ml、
[0052] GM-CSF 的濃度為 5ng/mL、
[0053] IL-4 的濃度 5ng/mL、
[0054] rhIL-4 的濃度為800U/ml、
[0055] 和 IL-13 的濃度為 5ng/mL;
[0056] 第二誘導劑中，
[0057] rhTNF-a 的濃度為800U/ml、
[0058] 沒食子酸的濃度為5μg/ml，
[0059] 或核桃青皮提取物的濃度為10μg/ml。
[0060] 實施例3
[0061] 與實施例1的不同之處在于，在本實施例中，
[0062]所采用的第一誘導劑中，
[0063] rhGM-CSF 的濃度為 1200U/ml、
[0064] GM-CSF 的濃度為 15ng/mL、
[0065] IL-4 的濃度 15ng/mL、
[0066] rhIL-4 的濃度為 1200U/ml、
[0067] 和 IL-13 的濃度為 15ng/mL;
[0068] 第二誘導劑中，
[0069] rhTNF-a 的濃度為 1200U/ml、
[0070] 沒食子酸的濃度為15μg/ml，
[0071] 或核桃青皮提取物的濃度為30μg/ml。
[0072] 為進一步驗證本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法及其所獲得的樹突狀細 胞具有顯著的有益效果，設置以下實驗進行驗證。
[0073] 檢測組1~3-分別對應本發明實施例1~3所提供的成熟的樹突狀細胞；
[0074] 對照組-為采用現有方法獲得的樹突狀細胞。
[0075] 1.細胞表型的FACS分析
[0076]分別收集檢測組和對照組4組樹突狀細胞，加入PBS溶液懸浮細胞，調整細胞濃度 至為IX 106/ml，取100μΙ加入離心管，然后分別加入熒光標記抗體(抗⑶86、⑶11b、⑶11c及 I-Ab單抗)調整終濃度為5μg/ml，置4°C冰箱中，避光反應15min，添加 roS溶液洗滌2遍，以熒 光標記的同型Ig作為對照，上機(FACS calibur)檢測細胞焚光強度，Cellquest軟件分析。
[0077] 采用流式細胞術檢測兩組樹突狀細胞免疫分子表型熒光強度的比較(x±s)，檢測 結果如下表1:
[0078] 表 1
[0079]
[0080] 檢測結果:CD86含量高于CDllc和la說明樹突狀細胞表面共刺激分子活化T細胞的 第二信號CD86高表達，由表1數據可知，本發明提供的成熟的樹突狀細胞表面免疫分子活化 T細胞的能力較強。
[0081 ] 2』1^六法測定細胞因子（幾-10和11^-12?70)的含量
[0082]分別收集檢測組1~3和對照組促成熟后的樹突狀細胞的上清液驚醒ELISA檢測， 檢測上清中IL-10與IL-12p70的分泌情況，檢測數據見下表2，IL-10與IL-12p70的分泌水平 (x±s)，（單位:pg/ml)
[0083] 表 2
[0084]
[0085] 檢測結果：由表2數據可知，檢測組1-3中，樹突狀細胞分泌的IL_12p70的水平遠大 于IL-10,而IL-12p70能夠直接作用CD8+T細胞使其增殖，增強細胞免疫效應以及形成長久 記性T淋巴細胞，能夠分泌高水平的IL12是樹突狀細胞生物活性高的標志之一；由此可知， 通過本發明所獲得的樹突狀細胞生物活性優于對照組通過現有技術所獲的樹突狀細胞的 生物活性。
[0086] 3. CCK-8法抗原肽特異性T細胞的增殖反應
[0087] 分別對檢測組1~3和對照組細胞執行以下操作：
[0088] 將抗原肽負載并促成熟后的樹突狀細胞與T細胞以細胞數1:10的比率共培養5天 后，用CCK法檢測T細胞的增殖情況。
[0089] 表3為檢測組和對照組影響T細胞增殖反應的比較（％，x土s)
[0090]
L009U 檢測結果：樹突狀細胞作為抗原呈遞細胞的一個重要的功能是刺激T細胞增殖，因 此，樹突狀細胞能否激活細胞毒性T淋巴細胞是檢驗樹突狀細胞功能的關鍵問題。由表3中 數據可知，通過本發明提供的誘導樹突狀細胞成熟的方法所獲得的樹突狀細胞能夠促進并 提高T細胞的增值率，增強免疫反應能力。
[0092]以上對本發明的實施例進行了描述，但是本發明并不局限于上述的具體實施方 式，上述的【具體實施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領域的普通技術人員在本發 明的啟示下，在不脫離本發明宗旨和權利要求所保護的范圍情況下，還可做出很多形式，這 些均屬于本發明的保護之內。
【主權項】
1. 一種誘導樹突狀細胞成熟的方法，其特征在于，包括以下步驟： 獲取樹突狀細胞前體單個核細胞，經第一誘導劑培養4~7天，每隔2~3天更換培養基， 獲得未成熟樹突狀細胞； 然后，再添加第二誘導劑培養所述未成熟樹突狀細胞2~4天至樹突狀細胞成熟； 其中，第一誘導劑包括:rhGM-CSF、GM-CSF、IL-4、rhIL-^PIL-13; 第二誘導劑包括rhTNF-α、沒食子酸或核桃青皮提取物。2. 根據權利要求1所述的誘導樹突狀細胞成熟的方法，其特征在于，所述第一誘導劑 中，rhGM-CSF的濃度為800~1200U/ml、GM-CSF的濃度為5~15ng/mL、IL-4的濃度為5~ 15]^/1111^、1']111^-4的濃度為800~12001]/1111和11^-13的濃度為5~15]^/111匕3. 根據權利要求2所述的誘導樹突狀細胞成熟的方法，其特征在于，所述第一誘導劑 中，rhGM-CSF 的濃度為 1000U/ml、GM-CSF 的濃度為 10ng/mL、IL-4 的濃度為 10ng/mL、rhIL-4 的濃度為l〇〇〇U/ml和IL-13的濃度為10ng/mL。4. 根據權利要求2所述的誘導樹突狀細胞成熟的方法，其特征在于，所述第二誘導劑 中，rhTNF-a的濃度為800~1200U/ml、沒食子酸的濃度為5~15μg/ml，或核桃青皮提取物的 濃度為10~30μg/ml。5. 根據權利要求4所述的誘導樹突狀細胞成熟的方法，其特征在于，所述第二誘導劑 中，rhTNF-a的濃度為l〇〇〇U/ml、沒食子酸的濃度為10μg/ml，或核桃青皮提取物的濃度為20 μg/ml〇6. 根據權利要求1所述的誘導樹突狀細胞成熟的方法，其特征在于，所述樹突狀細胞前 體單個核細胞來源于外周血。7. 根據權利要求6所述的誘導樹突狀細胞成熟的方法，其特征在于，所述樹突狀細胞前 體單個核細胞的獲取過程，包括以下步驟： 抽取外周靜脈血，稀釋，添加淋巴細胞分離液離心10~20分鐘后，分離獲取外周血單個 核細胞;用完全培養基懸浮細胞濃度至(2~6) X 106個/ml，孵育1~3小時，更換新的完全培 養基，收集細胞懸液，即為樹突狀細胞前體單個核細胞懸液。8. 根據權利要求7所述的誘導樹突狀細胞成熟的方法，其特征在于，所述完全培養基中 含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml鏈霉素。9. 根據權利要求1所述的誘導樹突狀細胞成熟的方法，其特征在于，還包括以下步驟： 添加所述第一誘導劑之前，需調節所述樹突狀細胞前體單個核細胞濃度為（1~3) X106個/ ml〇10. -種樹突狀細胞，其特征在于，是由權利要求1~9任一項所述的誘導樹突狀細胞成 熟的方法所獲得的。
【專利摘要】本發明涉及一種誘導樹突狀細胞成熟的方法，包括以下步驟：獲取樹突狀前體細胞單個核細胞，經第一誘導劑培養4～7天，獲得未成熟樹突狀細胞；然后，再添加第二誘導劑培養所述未成熟樹突狀細胞2～4天至樹突狀細胞成熟；其中，第一誘導劑包括：rhGM-CSF、GM-CSF、IL-4、rhIL-4和IL-13；第二誘導劑包括rhTNF-α、沒食子酸或核桃青皮提取物。本發明進一步涉及由上述方法所獲得的樹突狀細胞。與現有技術相比，本發明提供的方法提高樹突狀細胞的細胞活性，提高樹突狀細胞細胞的增值率及成熟率，進而提高樹突狀細胞的抗原提呈性。
【IPC分類】C12N5/078, C12N5/0784
【公開號】CN105647867
【申請號】
【發明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫學科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月28日