小鼠抗人her-2單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及以原核表達的HER-2蛋白免疫小鼠獲得的分泌HER2單克隆抗體的雜交瘤細胞株6H8，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]HER-2是定位于17號染色體短臂(17q21)的原癌基因c-erbB-2的表達產物。HER-2在人和嗤齒類中也稱作c-erbB-2或neu，是一種由1255個氨基酸殘基構成，相對分子質量為185kDa，具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體樣蛋白，由胞外區、跨膜區及胞內區構成，是表皮生長因子受體(HER)家族成員之一。目前已知該家族包括四個相關的蛋白酪氨酸激酶受體:HER-1 (erbB-1/EGFR)、HER-2 (erbB2/ neu)、HER-3 (erbB3)及HER-4 (erbB4)，這些蛋白酪氨酸激酶受體在細胞表面與特異的天然受體或生長因子相互作用。
[0003]HER-2在調節腫瘤細胞生長、分化及存活起著重要作用，并參與正常乳腺細胞生長和發展的調節，與腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移密切相關。通常情況下，HER-2只在胎兒期表達，到成年后，也只在極少數組織內低表達。HER-2的過表達是由原癌基因擴增或轉錄異常，或基因突變激活所致。在人類腫瘤中，特別是乳腺癌、卵巢癌、非小細胞癌等許多惡性腫瘤中都存在HER-2不同程度的過表達。
[0004]HER-2在腫瘤發生中起重要作用，主要通過多種途徑促進細胞的增殖、分化以及抑制凋亡。與正常細胞相的HER-2基因相比，從腫瘤中分離出來的HER-2基因由于跨膜區的氨基酸序列變異而具有轉化性。有報道HER-2過表達在乳腺腺病與乳腺癌質檢差異有高度顯著性，在癌旁上皮、乳腺癌組織學類型分級關系密切，對鑒別乳腺良惡性疾病具有輔助價值。HER-2過表達與淋巴結轉移、組織學分級呈正相關，與生存期呈負相關，可作為判斷乳腺癌預后的指標。
[0005]HER-2作為重要的乳腺癌預后判斷因子，其陽性(過表達或擴增)乳腺癌的臨床特點和生物學行為有特殊表現，治療模式也與其他類型的乳腺癌有很大的區別。HER-2狀態是預后判斷的制定有效治療方案的重要參考指標，更重要的是，HER-2陽性是患者采取HER-2基因靶向治療藥物治療的先決條件。
[0006]隨著HER-2相關分子研究的深入，國內外已經獲得了多種HER-2的單克隆抗體，但一直以來都需要表達量更多，親和性更好，稀釋度更高，具有更多優良特性的單克隆抗體。獲得活性高的HER-2的單克隆抗體對于臨床診斷和科學研究具有重要意義。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種高親和性的、可用于科研或臨床免疫組化檢測HER-2表達的小鼠抗人HER-2單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0008]為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案:
(I)根據HER-2的基因序列(NM_001005862.1)的編碼框，設計一對特異引物，TrizolReagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增HER-2基因，構建重組表達載體PET28a- HER-2，轉化大腸桿菌BL21感受態，IPTG誘導蛋白表達并親和純化蛋白作為抗原；
(2)采用經典的細胞融合技術制備HER-2單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測定抗體純度，直接ELISA法測定純化抗體的滴度；
(3)通過免疫組織化學分析HER-2單克隆抗體染色人乳腺癌石蠟切片；
(4)根據抗體基因的恒定區序列合成特異性引物，PCR擴增單克隆抗體HER-2重鏈可變區和輕鏈可變區，回收目的片段，克隆到PGEM-T載體中，轉化大腸桿菌TGl細胞后篩選陽性克隆，抽提質粒后測序確定了單克隆抗體HER2的重鏈和輕鏈可變區序列。
[0009]本發明提供的以原核表達的HER-2蛋白為抗原、免疫小鼠獲得的分泌HER-2單克隆抗體的雜交瘤細胞株，名稱為6H8，分類命名為小鼠抗人HER-2雜交瘤細胞系，該細胞株6H8已于2012年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC N0.6918。
[0010]本發明還提供了所述雜交瘤細胞株6H8，CGMCC N0.6918產生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區，重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO: 10。
[0011]本發明的優點和有益效果
本發明應用重組人的HER-2蛋白為免疫抗原，免疫BalbA^jnt，采用經典的細胞融合技術，通過ELI SA篩選，獲得一株能穩定分泌抗HER-2的雜交瘤細胞株，命名為6H8，亞型鑒定為IgGl，將雜交瘤細胞株擴大培養后收集上清，采用Protein A親和層析法對HER2單抗進行純化。SDS-PAGE結果顯示，純化后抗體純度在95%以上;ELISA滴度測定結果顯示，單抗的滴度均在1:10000以上。人乳腺癌石蠟切片經抗HER-2抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到細胞膜出現明顯棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色。從實驗結果上來看，本發明制備了高效價，高特異性的HER-2單克隆抗體，用該抗體檢測證實，其對細胞中的HER-2蛋白具有高識別能力，可用于科研或臨床免疫組化檢測HER-2表達。
【附圖說明】
[0012]圖1SDS-PAGE分析純化后的HER-2單克隆抗體。
[0013]圖2 ELISA法測定HER-2單克隆抗體滴度。
[0014]圖3是免疫組織化學檢測分析HER-2單克隆抗體染色人乳腺癌石蠟切片。
【具體實施方式】
[0015]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。
[0016]實施例1:雜交瘤細胞株6H8及其產生的單克隆抗體的獲得
1、抗原制備
(I)獲得目的基因
在該實施例中，根據HER-2的基因序列(ΝΜ_001005862.1)的編碼框，設計I對特異引物: 引物1:5，-GGATCCATGAAGCTGCGGCTCCCTGC-3’ (SEQ ID NO:1)
引物2:5'-5'-CTCGAGTCACACAGGCACGTCCAG ACC_3，；(SEQ ID NO:2) Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增HER-2基因
(2)構建重組表達載體
將步驟(I)獲得的PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達載體PET28a，構建重組質粒 PET28a-HER-2
(3)獲得含重組表達質粒的表達菌種
將步驟(2)獲得的連接產物轉化大腸桿菌BL21感受態，用含有硫酸卡那霉素的固體培養基篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞
(4)誘導表達和蛋白純化
將步驟(2)提取的質粒轉化BL21感受態，用含有硫酸卡那霉素的固體培養基篩選，挑選單克隆至1ml含有硫酸卡那霉素的LB液體培養基中培養，37°C，220rpm培養10h，取5ml液體培養基轉移至250ml的大瓶中繼續培養，培養至OD值為0.8，加入0.2mM IPTG誘導表達，16°〇誘導過夜，收集菌液超聲，取上清用N1-NTA瓊脂糖親和層析法純化HER-2蛋白。
[0017]2、單抗的制備和純化
(I)、免疫動物
一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行三次免疫注射。
[0018]首次免疫。純化的重組蛋白HER-2(用適量生理鹽水稀釋)+完全弗氏佐劑，10yg/只，頸背部皮下多點注射；
二次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白HER_2(用適量生理鹽水稀釋)+不完全弗氏佐劑，10yg/只，頸背部皮下多點注射；
三次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白HER_2(用適量生理鹽水稀釋)，不完全弗氏佐劑，10yg/只，頸背部皮下多點注射；
三次免疫后7?10天采血，用建立的ELISA法檢測效價，選擇效價最高者用于細胞融合。
[0019]加強免疫(融合前3天)，用純化的重組蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾臟融合。
[0020](2)、細胞融合
采用眼球摘除放血法處死小鼠，