無菌操作取出脾臟，在平皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按一定比例混合(1:5-1:10)，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。采用HAT選擇性培養基，進行雜交瘤細胞的選擇性培養和篩選。
[0021 ]用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清:以純化的HER-2蛋白(10yg/ml)包被酶標板，每孔ΙΟΟμΙ，4°C包板過夜。甩掉包被液，加入200μ1 5%的脫脂奶粉，37°C封閉Ih后，洗滌3次，加雜交瘤細胞培養檢測上清ΙΟΟμΙ (陰性對照為PBS ΙΟΟμΙ)，37°C孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μ1，室溫靜置5分鐘，加終止液50μ1。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。OD值明顯高于陰性對照2倍以上者定為陽性。最后篩選得到一株分泌性能最佳的抗HER2雜交瘤細胞株，命名為6H8，亞型鑒定為IgGl。
[0022]將選出的陽性雜交瘤細胞株6H8克隆化培養(有限稀釋法)，獲得能產生高效價單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞株擴大培養，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細胞為抗人HER-2雜交瘤細胞系6H8，該細胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6918。
[0023](3)單克隆抗體的大量制備與純化
將步驟(2)獲得的細胞株6H8接種至Balb/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中提取抗體。單克隆抗體HER-2的純化:采用Protein A親和層析法。首先制備protein A親和柱，用PBS平衡柱子后，取抗HER-2的腹水過柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmo I/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脫，收集峰值區的洗脫液，經透析濃縮后備用。SDS-PAGE結果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖1)。
[0024](4)直接ELISA法測定純化抗體的滴度
以純化的HER-2蛋白(10yg/ml)包被酶標板，每孔ΙΟΟμΙ，4°C包板過夜。甩掉包被液，加入200μ1 5%的脫脂奶粉，37°C封閉Ih后，洗滌3次，將純化的抗體按1: 200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800進行稀釋，以每孔ΙΟΟμΙ加入酶標板中(陰性對照為PBSΙΟΟμΙ)，37°C孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μ1，室溫靜置5分鐘，加終止液50μ1。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。ELISA滴度測定結果顯示，單抗的滴度均在1:10000以上(參見圖2)。
[0025]實施例2:單克隆抗體免疫組化應用檢測
用HER-2單抗，按常規法作病理切片，對人乳腺癌石蠟切片進行免疫組化染色。
[0026]具體方法為
(I)脫蠟
切片依次置于二甲苯1、I1、III中脫蠟，每次5分鐘，移至無水乙醇1、11中各浸泡4分鐘，移至95%酒精中浸泡4分鐘，移至85%酒精中浸泡4分鐘，再移至70%酒精中浸泡4分鐘，流水沖洗2分鐘
(2)抗原修復
將已沖洗干凈組織切片放入高壓鍋內，加入約3000ml左右的檸檬酸鹽抗原修復液(PH6.0)，高火加熱煮沸后調至低火保持沸騰噴氣3分鐘，關掉電磁爐開關，兩分鐘后將高壓鍋移至冷水中冷卻，待高壓鍋內抗原修復液完全冷卻后，打開高壓鍋將組織切片用流水沖洗干凈移至蒸餾水中浸泡2分鐘
(3)阻斷
將組織切片置于3ffi202中浸泡10分鐘，以流水和蒸餾水分別沖洗。取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍畫一圓圈，注意圈接頭要接好，防止抗體跑出圈外造成假陰性。PBS緩沖液沖洗
(4)滴加一抗
甩去待測組織切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗為實施例1步驟(3)制備并純化的HER-2單克隆抗體，稀釋度為1:5000。放置在孵育盒內4°C冰箱中過夜孵育約12小時
(5)滴加二抗
將孵育盒從冰箱取出，恢復至室溫后取出切片，用PBS洗3次，每次5分鐘。滴加通用型二抗-HRP聚合物。將切片放入孵育濕盒中，蓋上蓋子，連孵育盒一起放入37°C恒溫箱中孵育30分鐘
(6)顯色、襯染、封片取出切片，擦掉組織周圍的多余的ros，加入DAB顯色液中顯色3?5分鐘，在顯微鏡下控制染色的強度。待強度適中后將切片置自來水中終止顯色，再用流水沖洗5?10分鐘，蘇木素染液復染I分鐘，0.5%鹽酸酒精分化3秒鐘，流水沖洗5?1分鐘，脫水、透明、封片、鏡檢結果判定:按照國外學者對組織中HER-2的判定標準，HER-2蛋白陽性反應為出現明顯棕黃色顆粒，定位于細胞膜。人乳腺癌組織(參見圖3)經抗HER-2抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到細胞膜出現明顯棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色，說明此HER-2小鼠單克隆抗體可以特異性的應用于免疫組織化學實驗。
[0027]實施例3:單克隆抗體可變區測序根據抗體基因的恒定區序列合成以下引物:
zh08 5’-GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3’ (SEQ ID NO:3)zhrll 5’-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3’ (SEQ ID NO:4)z10I 5’-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’ (SEQ ID NO:5)zlr05 5’-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3’ (SEQ ID NO:6)Trizol Reagent試劑分別提取5 X 16雜交瘤細胞6H8的總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA。用zh08和zhrll為引物進行PCR擴增單克隆抗體HER2重鏈可變區，用zlOl和zlr05為引物進行PCR擴增單克隆抗體HER2輕鏈可變區，PCR反應均采用熱啟動，反應條件:94°C 5分鐘;94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30個循環;72°C 7分鐘。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化目的片段(輕鏈長度391 bp，重鏈長度420 bp)。克隆到pGEM-T(Promega)載體中，轉化大腸桿菌TGl細胞后在IPTGIX-gal平板上進行篩選，取白色菌斑接種于含有氨韋青霉素的LB液體培養基中擴增。篩選陽性克隆，用QIAGEN的質粒抽提試劑盒抽提質粒并進行測序，確定了單克隆抗體HER2的重鏈和輕鏈可變區序列。
[0028]單克隆抗體HER-2可變區的DNA序列和氨基酸序列: 單克隆抗體冊1?-2重鏈可變區0嫩序列(5’43’，398&?) (SEQ ID NO:7); 單克隆抗體肥卜2的輕鏈可變區0嫩序列(5’—3’，418匕？) (SEQ ID N0:8)；
單克隆抗體HER-2重鏈可變區的推斷氨基酸序列(139氨基酸)(SEQ ID N0:9);
單克隆抗體HER-2輕鏈可變區的推斷氨基酸序列(131氨基酸)(SEQ 10 ID NO: 10)。
【主權項】
1.一種以原核表達的HER-2蛋白免疫小鼠獲得的分泌HER-2單克隆抗體的雜交瘤細胞株6H8，保藏編號為CGMCC N0.6918。2.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞株6H8產生的重鏈可變區氨基酸序列為SEQIDN0:9，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO: 10的免疫球蛋白。
【專利摘要】一種小鼠抗人HER-2單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。所述的分泌HER-2單克隆抗體的雜交瘤細胞株克隆號為6H8，保藏編號為：CGMCC？No.？6918。本發明還提供了所述雜交瘤細胞株6H8產生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區，重鏈可變區氨基酸序列為SEQ？ID？NO:9，輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ？ID？NO:10。該抗體可用于科研或臨床免疫組化檢測HER-2表達。CGMCC No. 691820121127
【IPC分類】C12R1/91, C12N5/20, C07K16/28
【公開號】CN105647874
【申請號】
【發明人】何小丹, 劉晨, 郝軍鳳
【申請人】天津三箭生物技術股份有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月30日