煙4U的上限， 評吸合計值較低。表1:
注:表中香氣質包括細膩度、圓潤性和綿延感;刺激性包括對口腔、鼻腔、喉部的刺激 性;雜氣包括枯焦、粉雜掘、生青氣和其他雜氣。
[0048] ②山東臨沂B3F煙樣評吸結果(見表2) 從表2評吸結果來看，酸性木聚糖酶對山東臨沂B3F煙樣品質改善提高效果不明顯。除 對勁頭無效外，對各項均有一定的均衡改善略有增值，仍以lmL用量發酵7d評吸值增加到最 大值，合計值僅比對照增加1 %。2mL、3mL用量下偏離適宜用酶范圍出現了合計值下降現象。 20d與7d的各項分值相同，而40d時主要表現為香氣質改善，得分從小于對照9.5分的9分增 加為與lmL酶用量下相同的大于對照值10分，合計值成為正增長值。山東煙草異于云南煙 草，這種提高較小，較為均衡的情況值得深入研究，明了這種問題，將使酸性木聚糖酶有更 多應用對象。表2:
[0049] (七)濃縮酸性木聚糖酶原液制劑作為第二次潤葉用水取樣分析檢測及結果 為了檢驗本發明酸性木聚糖酶制劑作為第二次潤葉用水的效果，以云南大理紅大 VC03C和云南大理紅大VC03B兩種煙樣為處理對象，在實驗室條件下模擬煙葉片煙復烤醇化 過程，考察濃縮酶制劑對醇化（自然發酵)前期的影響。將3500U/mL的濃縮酸性木聚糖酶制 劑用自來水稀釋250倍作為片煙復烤前的第二次潤葉用水，酸性木聚糖酶最佳酶活力為 14U/mL。對照用相同量的自來水作為潤葉水。打葉、復烤后，各個包裝500g煙葉，處理平行重 復不少于3次，在相對濕度65%的室溫下自然醇化60天，分別制成煙絲混勻，取樣分析。
[0050] ①處理煙葉常規分析 根據檢測，云南大理紅大VC03C處理煙樣與對照相比：總糖下降7.5%、鉀離子上0.42%、 還原糖下降5.4%、總植物堿下降4.1%、氯離子上升11. .25%、總氮下降1.75%; 云南大理紅大VC03B處理煙樣與對照相比：總糖下降4.7%、鉀離子下降0.88%、還原糖下 降2.4%、總植物堿下降0.33%、氯離子上升6.85%、總氮下降1.04%。
[0051] 兩種處理煙樣對比很明顯，出現VC03C煙樣各檢項升降幅度大于VC03B煙樣。特別 是鉀離子在VC03B煙樣中反而較大幅度的下降。說明：酸性木聚糖酶對VC03B煙樣的鉀離子 影響還起反作用。
[0052]②致香成分 根據樣品分析，云南大理紅大VC03C處理樣的致香成分總量比對照樣增加了22.7%;而 云南大理紅大VC03B處理樣也比對照樣有所增加，說明此處理方法對于增加致香成分總量 是有效的。按類別其中VC03C煙樣的醇類物質比對照樣增加了 13%，VC03B煙樣同樣有所增 加;VC03C煙樣中酚類物質量高于對照。相反，VC03B煙樣則是有所下降;醛和酮類物質VC03C 煙樣中都有增加(其中酮類增加了 16%)，在VC03B煙樣中僅有略增加;酸類物質VC03C煙樣中 增加了 147%，VC03B煙樣中也比對照樣增加了近10%;酯類化合物VC03C煙樣增加了 15%， VC03B煙樣則也有所增加。
[0053] 致香成分在VC03C煙樣中效果明顯，致香成分比對照樣增加了22.7%，在VC03B煙樣 中除酚類物質外的都有所增加。總體上來說酸性木聚糖酶對煙草致香成分的形成累積增 加，是積極有效的。至于VC03B煙樣增加較少的之一原因，可能酶用量偏離適宜范圍的原因。 2%〇的用酶量相當于用了最佳的兩倍，相當于每lg煙樣受到7U酸性木聚糖酶的作用。在 "(三)濃縮酸性木聚糖酶原液制劑的酶活力評吸檢測及效果"中，評吸結果中也是在香韻香 氣量和口感干凈度上得分值低于最佳用酶量的處理效果。
【主權項】
1. 以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑，其特征是：該制劑酸性木聚糖 酶的酶活力在50°C和PH4.5下為3000~4000U/mL。2. 根據權利要求1所述的酶制劑，其特征是：該制劑酸性木聚糖酶的最佳酶活力為 3500U/mL〇3. 制備如權利要求1~2之一種所述的以酸性木聚糖酶作為煙草加工輔助添加的酶制 劑的方法，包括以下步驟： (1) 用pH4.5緩沖液溶解蛋白酶活性抑制劑PMSF，PMSF在緩沖液中的濃度為0.0 lmol/L， 再按緩沖液與水的體積比1:4稀釋緩沖液;將市售的酸性木聚糖酶固體物酶源與稀釋緩沖 液該兩者按重量體積比1 g: 10~20mL混勻得混合液，加入NaCl攪拌溶解，混合液與NaCl的 重量體積比為〇. 75g /L;過濾，收集濾液作為待精制處理的粗酶液，靜置； 上述緩沖液為Britton-Robinsion緩沖液； 上述在市售的酸性木聚糖酶固體物酶源中加入PH4.5的稀釋緩沖液的量與酶源的原始 酶活力呈正相關； (2) 在步驟（1)靜置1 h的粗酶液中加入(NH4) 2S〇4，（順4) 2S〇4濃度為25 %，緩慢攪拌溶解， 靜置2h;繼續加入(NH4)2S04濃度至80%，靜置過夜，離心得到第一次沉淀;所得上清液則補加 10%的(NH 4)2S04靜置過夜后，再離心得第二次沉淀，合并以上兩次沉淀； 所述(NH4)2S〇4濃度為重量體積比； (3) 配制濃度為0.1%的EDTA溶液，該溶液與沉淀的體積比為1:2; 將步驟(2)收集的沉淀與pH4.5的稀釋緩沖液按體積比2:1混勻后加入以上EDTA溶液， 靜置，離心，得到去除金屬離子的酶上清液； (4) 往酶上清液加入濃度為0.01%的蔗糖低聚物，酶上清液與蔗糖低聚物的體積比為 100:1，作為初制品，-8 °C冷凍干燥濃縮至初制品的1/8~1/10倍，得酶活力為3000~4000U/ mL濃縮的酸性木聚糖酶制劑，其中，濃縮的酸性木聚糖酶制劑的最佳酶活力為3500U/mL; 所述蔗糖低聚物濃度為重量體積比。4. 根據權利要求3所述的酶制劑制備方法，其特征是:所述步驟（1)ρΗ4.5的稀釋緩沖液 中加有Ca(N03) 2、MgS〇4、ZnS〇4和 FeS〇4,其中，Ca(N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和 FeS〇4分別與緩沖液 的重量體積比為〇.3g /100mL，以恢復酶制劑的酸性木聚糖酶酶活力，及在50°C下所測定的 酶活力。5. 根據權利要求3或4所述的酶制劑制備方法，其特征是:步驟(1)酶源的原始酶活力5， 〇〇〇U/g，酸性木聚糖酶固體物與pH4.5的稀釋緩沖液該兩者按重量體積比1 g: 10mL:酶源的 原始酶活力10，〇〇〇U/g，酸性木聚糖酶固體物與pH4.5的稀釋緩沖液該兩者按重量體積比1 g：20mL〇6. 根據權利要求3或4所述的酶制劑制備方法，其特征是:步驟(4)以濃度為0.01%的β-環糊精替代蔗糖低聚物，酶上清液與環糊精的體積比為100:1，作為初制品，_8°C冷凍干 燥濃縮至初制品的1 /8~1 /10倍，得酶活力為3000~4000U/mL濃縮的酸性木聚糖酶制劑。7. 根據權利要求5所述的酶制劑制備方法，其特征是:步驟(4)以濃度為0.01%的β-環糊 精替代蔗糖低聚物，酶上清液與β-環糊精的體積比為100:1，作為初制品，_8°C冷凍干燥濃 縮至初制品的1 /8~1 /10倍，得酶活力為3000~4000U/mL濃縮的酸性木聚糖酶制劑。8. 應用如權利要求1~2所述之一種的酸性木聚糖酶作為煙草加工輔助添加的酶制劑 的方法，其特征是:該原液制劑以戊聚糖含量在11%~19%的煙草作為適宜的處理對象。9. 根據權利要求8所述的酶制劑的應用方法，其特征是:將酶活力為3000~4000U/mL的 濃縮的酸性木聚糖酶制劑稀釋250倍作為片煙復烤前的第二次潤葉用水，其使用的酶活力 范圍為12~16U/mL。10. 根據權利要求8所述的酶制劑的應用方法，其特征是:將酶活力為3500U/mL的濃縮 的酸性木聚糖酶制劑稀釋250倍作為片煙復烤前的第二次潤葉用水，其最佳酸性木聚糖酶 酶活力為14 U/mL。
【專利摘要】以市售的酸性木聚糖酶制備煙草加工的輔助酶制劑及應用，屬于煙草復烤前添加的可提高煙草品級的酶制劑。本發明酶制劑的酶活力在50℃和pH4.5下為3000？U/mL～4000U/mL，優選3500U/mL，該酶活力是在稀釋緩沖液中加有Ca(NO3)2、MgSO4、ZnSO4和？FeSO4恢復酶活性后測定的。制備：以市售的酸性木聚糖酶為制備酶源，用加有PMSF的Britton-Robinsion緩沖液并加入NaCl攪拌溶解，過濾，收集濾液，再用？(NH4)2SO4濃度分次沉淀、離心，收集沉淀，并進一步去除金屬離子和冰凍濃縮等。應用：以聚戊糖含量在11%～19%的煙草作為適宜的處理對象，稀釋制劑250倍作為片煙復烤前的第二次潤葉用水。
【IPC分類】A24B15/30, C12N9/42, A24B15/20
【公開號】CN105647889
【申請號】
【發明人】韓偉, 黃文榮, 劉士清, 張無敵, 尹芳, 陳應昆, 何寶玉, 趙春雷, 雷宇, 王金浩, 王應中, 韓夢璇, 趙剛
【申請人】云南萬芳生物技術有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月25日