內切幾丁質酶及其編碼基因和在生產幾丁二糖中的應用【
技術領域：
】[0001]本發明涉及一種幾丁質酶基因。更具體地涉及一種內切幾丁質酶基因及其在制備幾丁二糖中的應用。屬于生物工程領域。【
背景技術：
】[0002]幾丁質（Chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4_糖苷鍵連接而成的不溶于水的線性多聚物(Bendtetal.Cloning,expression,andcharacterizationofachitinasegenefromtheAntarcticpsychrotolerantbacteriumVibriosp.strainFi:7.Extremophiles,2001，5:119-126)，是自然界中含量僅次于纖維素的可再生生物質，每年生物界合成的幾丁質高達上百億噸。幾丁質廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲的甲殼以及真菌和植物的細胞壁中。幾丁質及其衍生物，如幾丁寡糖和殼聚糖等，由于在抗菌和抗腫瘤等方面具有較高的利用價值，近年來受到人們越來越多的重視。傳統幾丁質相關產品的生產主要是通過化學酸水解法來獲得，生產過程對環境造成了較大的污染。酶催化水解幾丁質制備幾丁寡糖等產品是一種高效、環保的制備方法，該方法的關鍵是獲得性能優良的幾丁質酶。[0003]幾丁質酶（Chitinase，EC3.2.1.14)是一類糖苷鍵水解酶，能夠特異性地催化水解幾丁質鏈中的β-1，4_糖苷鍵生成幾丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖（Bhattacharyaetal.Bacterialchitinases:Propertiesandpotential.CriticalReviewsinBiotechnology，2007,27:21-28)。幾丁質酶水解幾丁質生成的幾丁寡糖具有一些獨特的功能特性，在食品、醫藥、化妝品和飼料等方面具有廣泛的應用價值。如這些低聚糖具有清爽的甜味，在水中溶解度比單糖低，因此有助于調整食品中的水活性，且兼具調味和改良食品質構的功能；其次幾丁寡糖還可促進腸道內益生菌的增殖，并抑制腸道病原菌的生長，是一種良好的雙歧桿菌增殖因子；此外幾丁寡糖的吸濕和保濕性好，可用作保濕乳液、化妝水的原材料。幾丁質酶除了在幾丁質生物轉化中具有重要的作用，同時一些幾丁質酶還具有抗菌活性，在農作物生物防治中也具有很大的應用潛力。[0004]關于幾丁質酶的研究國內已有一些專利報道，如專利【申請號】201210510998.0，從檸檬酸桿菌中克隆得到了幾丁質酶基因，并獲得重組蛋白CHI-X;專利【申請號】201110258893.6,篩選得到一株產幾丁質酶的細菌Chitiniphilushaikoumangrovensis，并利用該菌所產的幾丁質酶降解膠體幾丁質制備幾丁寡糖。國際上關于細菌幾丁質酶的研究報道相對較多，尤其是類芽孢桿菌屬菌株，如Paenibacillussabina、Paenibacilluschitinolyticus、Paenibacillussp.Dl>Paenibacilluspabuli和Paenibacillussp.FPU-7等(Pateletal.StatisticaloptimisationofmediumcomponentsforchitinaseproductionbyPaenibacillussabinastrainJD2.AnnalsofMicrobiology,2007,57:589-597；Ahmadietal.Isolationandcharacterizationofachitionolyticenzymeproducingmicroorganism,PaenibacilluschitinolyticusJK2fromIran.JournalofMicrobiology,2008,3:395-404；SinghAK.OptimizationofcultureconditionsforthermostablechitinaseproductionbyPaenibacillussp.D1.AfricanJournalofMicrobiologyResearch,2010,4:2291-2298；Itohetal.Cooperativedegradationofchitinbyextracellularandcellsurface-expressedchitinasesfromPaenibacillussp.strainFPU-7.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2013,79:7482-7490)。國內僅見：嗜幾丁質類芽抱桿菌菌株CH11幾丁質酶特性研究.江蘇農業科學，蔣志強等，2006,1:47-49,研究嗜幾丁質類芽孢桿菌（Paenibacilluschitinolyticus)產幾丁質酶的情況。目前國際上尚無巴倫葛茲類芽孢桿菌（Paenibacillusbarengoltzii)產幾丁質酶的研究報道。[0005]幾丁二糖是一種中間體，在合成各種復雜的活性寡糖及多糖中具有重要作用，但是其制備非常麻煩且價格昂貴。Matsuokaetal.AnimprovedpreparationofN,N'-diacetylchitobiosebycontinuousenzymaticdegradationofcolloidalchitinusingdialysistubingasaconvenientseparator.Biomacromolecules,2000,1:798-8〇〇,利用透析管作為分離裝置連續酶解膠體幾丁質產幾丁二糖，其水解率達到36%。Cottazetal.GeneticengineeringofEscherichiacolifortheproductionofN1，Nn_diacetylchitobiose(chitinbiose)anditsutilizationasaprimerforthesynthesisofcomplexcarbohydrates.MetabolicEngineering,2005,7:311-317,應用根瘤霉幾丁質酶水解幾丁質制備幾丁二糖，產量達到4g/L。Ilankovanetal·ProductionofN-acetylchitobiosefromvariouschitinsubstratesusingcommercialenzymes.CarbohydratePolymers,2006,63:245-250,應用商業幾丁質酶水解不同幾丁質底物生產幾丁二糖，產物中幾丁二糖的含量為71.5%，另含有19%幾丁單糖和9.5%幾丁三糖。已有的研究報道不僅幾丁二糖的產率低，而且其含量也低，為后續分離純化帶來很大難度，因此制備技術有待進一步提商。[0006]國內關于幾丁質酶的研究起步較晚，目前還沒有實現產業化。能否獲得產酶量高、酶學性質優異的幾丁質酶，對于提高我國幾丁質資源利用的效率具有重要意義。[0007]本發明從中國南海地區采集的海水樣品中，篩選得到一株耐熱細菌巴倫葛茲類芽孢桿菌，從該菌株中克隆得到一個幾丁質酶基因并進行了異源表達，獲得重組幾丁質酶并研究了該酶的酶學性質，最后應用該重組酶水解幾丁質制備高純度幾丁二糖。【
發明內容】[0008]本發明的目的在于提供一種內切幾丁質酶，名稱為PbChi70,來源于巴倫葛茲類芽孢桿菌（Paenibacillusbarengoltzii)。本發明的另一個目的是提供一種表達幾丁質酶PbChi70蛋白的方法和在生產幾丁二糖中的應用。[0009]本發明提供的內切幾丁質酶PbChi70蛋白質，是如下1)~3)中的一種蛋白質：[0010]1)由序列表中序列2第40~696所示的氨基酸序列組成的蛋白質；[0011]2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；[0012]3)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幾丁質酶活性的由1)衍生的蛋白質。[0013]所述衍生的蛋白質是指通過物理誘變、化當前第1頁1 2 3 4