5g /L加入 0.825g NaCl，攪拌充分溶解，過濾，收集濾液，靜置lh待后續處理。
[0025]所述市售的酸性木聚糖酶固體物的酶源的原始酶活力以此參考，而與pH4.5的稀 釋的Britton-Robinsion緩沖液加入量呈正相關。
[0026] 所述pH4.5的稀釋的Britton-Robinson緩沖液是與水按二者體積比為1:4配制的 溶液，并在pH測量計下，用2mol/L NaOH溶液調到所需pH值4· 5。
[0027] 進一步，上述口!14.5的稀釋的131'；[1:1:011-1?013；[118；[011緩沖液中均溶解有?]\07蛋白酶活 性抑制劑，PMSF的濃度為0.01m 〇l/L，其用途在于避免蛋白酶活性破壞酸性木聚糖酶。
[0028] (2)兩種待后續處理的酶靜置液以下步驟相同，具體為： 取步驟（1)靜置液1L，加入(NH4)2S〇4至上清液的(NH4)2S〇4濃度為250g/L，攪拌溶解;靜 置2h，繼續加入（NH4)2S〇4,至(NH4)2S〇4濃度為800g/L，攪拌溶解;靜置過渡，4°C 15000r/ min離心30min，得第一次沉淀。僅取上清液，補加濃度100 g/L(NH4)2S〇4繼續靜置過夜，再4 °C 15000r/min離心30min，收集第二次沉淀和第一次沉淀合并。
[0029] (3)預先配制濃度為0.1% EDTA溶液，該0.1% EDTA溶液體積為步驟（1)起始用緩沖 溶液l〇〇〇mL體積的一半500mL。將步驟（2)所收集的沉淀與pH4.5的稀釋的Britton-Robinsion緩沖液按體積500mL混勻后加入以上0.1% EDTA溶液，即步驟(2)所收集的沉淀用 0.1%EDTA溶液和pH4.5的稀釋的Britton-Robinsion緩沖液恢復為1000mL的原始體積。靜 置，離心，得到去除金屬離子的酶上清液。
[0030] 上述EDTA為乙二胺四乙酸二鈉，可絡合沉淀除去在酶液中的二價金屬離子，避免 影響酸性木聚糖酶穩定性。
[0031] (4)往步驟(3)酶上清液中加入濃度(W/V)為0.01%的蔗糖低聚物，酶上清液與蔗糖 低聚物體積比為100:1，得初制品，該初制品經-8°c冷凍干燥濃縮至1/8~1/10倍，得酶活力 為3000~4000U/mL濃縮的酸性木聚糖酶制劑。
[0032]檢測各批次濃縮的酸性木聚糖酶制劑的酶活力，然后多批以酶活力高與低的相互 兌配，使制備產品的酸性木聚糖酶的酶活力為3500U/mL。
[0033]上述蔗糖低聚物為制糖工業應用的蔗糖酯聚合物，作用是穩定和保護濃縮液中的 酸性木聚糖酶，以延長商品貨架期。
[0034] 實施例2 針對以上實施例1的步驟(1)，在pH4.5的稀釋的Bri tton-Robinsion緩沖液中分別加入 Ca(N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和 FeS〇4,其中，Ca(N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和 FeS〇4分別與緩沖液的重量 體積比為〇.3g /100mL，以恢復酸性木聚糖酶的酶活力，并在50°C下測定結果。
[0035] 實施例3 在酶制劑制備方法的步驟(4)中，用濃度為0.01%的β-環糊精替代蔗糖低聚物，酶上清 液與β-環糊精的體積比為100:1，作為初制品，-8°C冷凍干燥濃縮至初制品的1/8~1/10倍， 得酶活力為3000~4000U/mL濃縮的酸性木聚糖酶制劑。
[0036] β-環糊精可替代蔗糖低聚物，效果更好，但價格比蔗糖低聚物高。
[0037](二)按《沼氣發酵實驗教程》檢測濃縮的酸性木聚糖酶原液制劑的酶活力 酶活力(性)是指在特定體系下測到的體現反應速度的酶表征結果。溫度和pH值是酶活 力測定及酶活力定義中的兩項基本要素，與本發明密切的酸性木聚糖酶更為明顯的是pH 值。
[0038] 以上《沼氣發酵實驗教程》(劉士清，張無敵，尹芳，等，沼氣發酵實驗教程，北京:化 學工業出版社，2013，pl35)為本發明人編撰。 酸性木聚糖酶酶活力單位(U)定義:在50°C和pH4.5下1%木聚糖底物溶液中反應10min， 每min產生Ιμπιο?/L木糖所需的酶量定義為1U。
[0039] 所述的酸性木聚糖酶原液制劑的酶活力測定，將需檢樣品稀釋成適宜酶測定的稀 釋倍數，是指用pH4.5的稀釋的Bri tton-Robinsion緩沖液來對酶原液制劑進行稀釋，稀釋 倍數以最終的〇D54Qr?值讀數在0.2~0.4范圍而確定。所用的緩沖液中每100mL中補加有Ca (N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和FeS〇4各0·3g作為基本的酶穩定與激活劑，恢復或增強酶活力。
[0040] 在25mL刻度試管中加入1.8mL用Britton-Robinson緩沖液配制的木聚糖溶液 (0.01 g/mL，緩沖液pH4.5)，在50 °C反應溫度下水浴預熱5min，準確計時加入適當稀釋度的 酶液V=0.2mL(200yL)，沸水浴保溫準確反應10min。加入DNS試劑以測定還原糖方法測OD54〇 nm 值。以木糖標準溶液，計算酶活力單位(μπιο 1 /mL或μπιο 1 /g )。
[0041] 酶活力 E=(nXW)/(M*XVX10) 式中:E-樣品的酶活力，U/g，或U/mL;W-由樣品平均0D值通過回歸方程得到的對應木 糖量，yg; η -樣品的稀釋倍數;V-參與反應的酶液量，mL; 10 -反應時間，min;麻一木糖分 子質量150 · 18，yg/ymol或g/mol。本發明反應底物為樺木木聚糖(Birchwood xylan，Sigma 公司）。
[0042] (三)應用酸性木聚糖酶作為煙草加工輔助添加的酶制劑的方法 我們研究發現，不同的煙草樣品的品種(系）、產地或年份，作為酸性木聚糖酶水解底物 的木聚糖含量差異較大，本發明酶制劑以戊聚糖含量在11%~19%的煙草作為適宜的處理對 象。
[0043]聚戊糖或稱戊聚糖是煙草半纖維素主要成分，采用間苯三酚比色法(Douglas法） (劉士清，張無敵，尹芳，等。沼氣發酵實驗教程。北京:化學工業出版社，2013，pl21-125)測 定煙草中聚戊糖含量，即可間接測定煙草中半纖維素含量。具體是： 取煙草樣品在105°C下烘干至恒重(另精確稱取1份以計含水量），粉碎過40目篩取5.0g 放入500mL的三角瓶中，加入100mL 12%Na0H溶液和50mL 2% H202,放入溫度45°C的搖床 120r/min旋轉搖瓶24h，3500r/min離心20min，上清液轉移到燒杯中，用總量不超過50mL的 蒸餾水懸浮洗沉淀3次，洗滌沉淀離心后的洗滌液同樣并入燒杯上清液中，用冰醋酸調節 pH3，加800mL無水乙醇或95%乙醇，放置過夜，離心沉淀得半纖維素，在60 °C下烘干，計算總 得率(數值可計為半纖維素的含量），得到的粗制半纖維素作為預處理的樣品。Douglas法測 定原理:在冰醋酸介質中，戊聚糖被熱酸水解，脫水生成糠醛后試劑與間苯三酚反應顯色， 顏色深淺與木糖濃度在3 · 0mg/L~40mg/L(3yg/mL~40yg/mL)之間呈線性關系，最大吸收波 長為552nm。
[0044] 使用方法： 將酶活力為3000~4000U/mL的濃縮酸性木聚糖酶原液制劑稀釋250倍作為片煙復烤前 的第二次潤葉用水，該稀釋后的酸性木聚糖酶酶活力范圍為12~16U/mL。
[0045] 最好是，將酶活力為3500U/mL的濃縮酸性木聚糖酶制劑濃縮液成品稀釋250倍作 為片煙復烤前的第二次潤葉用水，其最佳酸性木聚糖酶酶活力為14 U/mL。
[0046] (四）濃縮酸性木聚糖酶原液制劑的酶活力評吸檢測及效果 將5個平行測定酶活力為3518U/mL、3489 U/mL，3473 U/mL、3555 U/mL和3490 U/mL，混 合后酶活力平均為3505 U/mL。取3505 U/mL制劑lmL、2mL和3mL分別用250mL水稀釋，稀釋后 酶液酶活力分別是14.02U/mL、28.04U/mL和42.06U/mL。分別取25mL用噴槍均勻噴灑鋪放在 托盤中的3份，計100g/份煙片，相當于4g煙樣承受lmL稀釋酶液，即每lg煙樣分別受3.505U、 7.01U和10.515U的酸性木聚糖酶酶活力作用。然后，置于相對濕度65%，恒溫35°C下快速發 酵，發酵7 d、20d和40d時分別制備成煙支，以備評吸計分。
[0047] ①云南石林板橋B2F和B3F混合煙樣評吸結果(見表1) 從表1中評吸結果來看，酸性木聚糖酶對石林板橋B2F和B3F混合煙樣品質均有改善提 高的作用效果。lmL的用量符合片煙復烤前的第二次潤葉用水最佳酶劑量，發酵7d時，達到 了評吸值增加的最大值(除濃度值下降和對勁頭無效外，各項均有所改善增值），合計值較 對照增幅14%，說明品質明顯改善；20d時略有下降（表現在香氣質評分值下降），40d還存在 下降的趨勢(不但香氣質下降，香氣量也下降h2mL和3mL超出最佳酶劑量每lg