加 I級水 900ml溶解完全，調pH值至7.0-7.5，加 I級水定容至1L)。
[0130] 4.4 G25層析純化
[0131] 將實施例4.3純化獲得的樣品，使用5叩11&(1^6-2516虹11111層析柱純化，采用(：液 (10mM His，0.25M NaCl，pH6.0)平衡層析系統及層析柱，置換緩沖液，收集流穿下來的目的 蛋白保存在4°C備用。層析圖如圖6所示。
[0132] C緩沖液的配制：（取L-組氨酸0.7758，似(：114.68加1級水45〇1111溶解完全，調？!1值 至6.0,加 I級水定容至500ml)。
[0133] 4.5 Q HP層析純化
[0134] 將實施例4.4純化獲得的樣品，加入0.1%1>行〇1^-100混勻，采用0液（10禮！^， 0.9%NaCl，0.1%Triton X-100，pH6.0)平衡層析系統及Q HP層析柱，去除痕量非目標蛋 白，內毒素等雜質，收集流穿下來的目的蛋白保存在4°C備用。層析圖如圖7所示，電泳結果 如圖9所示。
[0135] D緩沖液的配制：（取L-組氨酸0.775g，氯化鈉注射液500ml，Triton x-1000.5ml， 調pH值至6.0)。
[0136] 實施例5 HPLC檢測
[0137] 使用C3 (購自Agi lent公司）對Vac 11蛋白進行純度檢測，用0.1 % TFA水溶液平衡柱 子，上樣10ul樣品，0.1 %TFA乙腈溶液洗脫，設定柱溫60°C，流速0.5ml/min。洗脫程序為： 10%~100%B，30min，通過曲線測出Vacll蛋白的純度，層析圖如圖10所示。
[0138] 0.1 %TFA水溶液的配制：1LI級水加 lmlTFA混勻，0.22μπι濾膜過濾。
[0139] 0.1 % TFA乙腈溶液的配制：1L乙腈加 lmlTFA混勻。
[0140]純化后的抗原，做以下實驗：
[0141] 實施例6免疫動物
[0142] 1)首次免疫，用roS稀釋Vacll抗原，加入濃度為lmg/mL的A1(0H)3;用5號半型針 頭，雙側腹股溝、足底及背部皮下對點注射，每只BALB/C小鼠注射量為100yL，并設置陽性對 照組、陰性對照組和空白對照組；
[0143] 2)第二次免疫，第7天進行第二次免疫，免疫組分同上，注射量蛋白抗原量是首次 免疫的1/2，免疫途徑冋上；
[0144] 3)第三次免疫，第14天進行第三次免疫，免疫組分同上，注射量蛋白抗原量與第二 次免疫相同，免疫途徑同上。
[0145] 實施例7抗體的檢測
[0146] 第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA檢測小鼠免疫后，IgG、 IgGl、IgG2a體液應答水平。
[0147] 1.制備液體
[0148] 1)包被液的配制：稱取Na2C031.6g，NaH⑶32.9g，溶于1L ddH20,用pH計將pH調至 9.6；
[0149] 2)封閉液的配制：lg牛血清V，溶于100mL抗體稀釋液（1:100);
[0150] 3)抗體稀釋液的配制：將磷酸鹽溶于1L ddH2〇,再加入500yL Tween 20,再用pH計 將pH調至7.4;
[0151] 4)洗滌液的制備：同抗體稀釋液
[0152] 5)顯色液(TMB)，為天根公司產品；
[0153] 6)終止液(2M H2S〇4)的制備:將22.2mL濃硫酸傾注入177.8mL ddH20中。
[0154] 2. ELISA檢測Vacl 1重組蛋白免疫小鼠產生的抗體效價
[0155] 1)用包被液將純化后的Vacll重組蛋白稀釋為：lug/mL、5ug/mL、10ug/mL;
[0156] 2)包被:將重組蛋白稀釋液加入酶標板，100μL孔，4°C過夜后用洗滌液洗滌3遍， 空干后用保鮮膜包上，置于4°C冰箱中備用；
[0157] 3)封閉：酶標板加封閉液200μ!7孔，置于37 °C孵育箱中2小時，洗滌3遍；
[0158] 4)將血清進行 1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000 等倍比稀釋；
[0159] 5)取封閉好的酶標板，依次加入稀釋血清，100μL孔，置于37°C孵育箱lh，洗滌3 遍，空干；
[0160] 6)將加 HRP標記的羊抗小鼠 IgG、IgGl、IgG2a抗體保存液，稀釋1:5000，制成抗體工 作液；
[0161] 7)加入稀釋抗體工作液，100μL7孔，置于37 °C孵育箱40min，洗滌三遍，空干；
[0162] 8)加入底物顯色液(TMB)lOOyL/孔，室溫避光反應5min;
[0163] 9)加入終止液(2M H2S〇4)，立即置于酶標儀上以450nm波長處測定0D值；
[0164] 10)結果判斷:A樣品/A陰性值^2.1為陽性（陰性對照為小鼠免疫前血清1:1000倍 稀釋）。
[0165] 結果:檢測Vacl 1蛋白抗原免疫小鼠產生的抗體效價達到1:1024000;免疫后第7天 的抗體陽性率達到1〇〇%，說明本發明構建的Vacll重組蛋白能夠使免疫小鼠體內產生抗 體。
[0166] 實施例8 Vacll重組蛋白動物免疫的攻毒保護評價
[0167] Vacll末次免疫后10~14天，用生理鹽水將準備PA XN-1菌液并調節濃度至1.5 X 101()CFU/mL，用異氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量為20yL，采用同樣 劑量的生理鹽水(NS)作為空白對照。感染結束后每隔1天觀察小鼠死亡情況，觀察周期為7 天，觀察期結束后剩余動物以C02吸入法安樂處死。統計各組小鼠的存活率。結果示于表1。
[0168] 表1 Vacll重組蛋白免疫小鼠后的攻毒保護效果
[0169]
[0170] 表1顯示：陰性對照組和空白對照組的平均免疫保護率分別為25%和20%，重組融 合蛋白Vacll加 A1(0H)3佐劑組的平均免疫保護率為62.5%。因此，本發明的Vacll重組蛋白 具有良好的免疫原性，能夠誘導機體產生免疫應答，并且能夠對PA XN-1的感染起到保護作 用，可以輔以鋁佐劑制備亞單位疫苗用于預防銅綠假單胞菌的感染。
【主權項】
1. 一種銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗候選抗原Vacll，其特征在于:該抗原的 核酸序列如SEQ ID N0:1所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。2. -種權利要求1所述抗原的純化方法。其特征在于，包括步驟:收集制備的所述抗原 Vacll;按照高壓破菌、離心;GST親和純化;Q HP層析純化;G 25層析純化;Q HP層析純化的 順序組合對制備的抗原進行純化。3. 根據權利要求2所述的純化方法，其特征在于： 1) 高壓破菌 收集的菌體作為目標蛋白，用pH為7.0-7.5的10mM 1?緩沖液混勻懸浮，預冷后采用高 壓勻漿破菌，高速離心，收集上清； 2. GST親和純化 GST親和層析填料進行初步純化，使用A液對目標蛋白進行純化，Prescission Protease酶進行酶切洗脫： 3. Q HP層析純化 將經步驟2)純化的目標蛋白，使用A平衡層析系統及Q HP層析柱，B液線性梯度洗脫； 4. G 25層析純化 將經步驟3)純化的目標蛋白，使用G25層析柱純化，采用C液平衡層析系統及層析柱，分 離純化目標蛋白，置換緩沖液； 5. Q HP層析純化 將經步驟4)純化的目標蛋白，加入0.1%Triton X-100混勻，采用D液平衡層析系統及Q HP層析柱，去除雜質，分離純化目標蛋白； 其中，A液為pH7.0-7.5的20mM Na2HP〇4-NaH2P〇4的緩沖溶液，B液為pH7.0-7.5的20mM Na2HP〇4-NaH2P〇4，lM NaCl，C液為ρΗ6·0的 10mM His，0.25M NaCl，D液為ρΗ6·0的 10mM His， 0.25M NaCl，0.1%Triton X-100。4. 根據權利要求3所述純化方法，其特征在于：步驟1)所述的高壓勻漿破菌采用60-80MPa，高速離心獲取破菌上清。5. 根據權利要求1所述純化方法，其特征在于:步驟2)所述的GST親和層析使用的填料 為Glutathione Sepharose 4B或Glutathione Sepharose 4FF或Glutathione Sepharose HP 〇6. 根據權利要求3所述純化方法，其特征在于:步驟2)所述的Prescission Protease酶 帶有GST標簽。7. 根據權利要求3所述純化方法，其特征在于：步驟3)所述的Q HP層析柱的填料為Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q〇8. 根據權利要求3所述純化方法，其特征在于：步驟4)所述的G 25層析柱為Sephadex G_25Coarse或Sephadex G_25Medium或Sephadex G_25Fine或Sephadex G_25Superfine〇9. 根據權利要求3所述純化方法，其特征在于：步驟5)所述的Q HP層析柱為Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q〇10. 根據權利要求2-9任一項所述的純化方法，其特征在于，所述抗原Vacll采用以下方 法制備： 1)設計正向引物和反向引物通過PCR擴增或全基因合成獲得銅綠假單胞菌亞單位重組 基因工程疫苗候原Vacll蛋白片段的核苷酸序列； 2) 將步驟1)獲得的核苷酸序列克隆表達至表達載體構建重組載體，然后將該重組載體 轉化至宿主菌； 3) 誘導轉換后的宿主菌表達重組蛋白。
【專利摘要】本發明公開了一種銅綠假單胞菌(PA)重組亞單位基因工程蛋白疫苗Vac11的純化方法。該蛋白為銅綠假單胞菌抗原分子的活性功能片段重組融合，通過大腸桿菌基因工程菌表達獲得。采用對基因工程菌進行高壓破菌、GST親和層析、PP酶酶切、Q？HP層析、G？25層析、Q？HP層析等層析技術，獲得高純度的銅綠假單胞菌(PA)重組亞單位基因工程蛋白Vac11。該發明純化方法工藝簡捷、容易放大、重復性好，所獲目標蛋白純度高，動物試驗證明可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。
【IPC分類】A61P31/04, A61K39/104, C07K1/22, C12N9/52, C07K1/16, C12R1/385
【公開號】CN105647894
【申請號】
【發明人】敬海明, 顧江, 鄒全明, 章金勇, 孫紅武, 付強, 牟道華, 張玉東, 徐麗敏
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月2日