tage 公司；
[0062] Tris 購自 ANGUS 公司；
[0063]硫酸購自成都科龍化工試劑廠；
[0064] 牛血清白蛋白V購自BI0SHARP公司；
[0065] 異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。
[0066] 實施例lVacll基因的克隆和重組質粒pGEX-6P-2_Vacll的構建
[0067] 1.根據銅綠假單胞菌PA01的AmpDh3蛋白全長基因序列，應用生物信息軟件進行結 構分析，確定需要擴增的Vacll目的基因片段。
[0068] 2.根據分析結果，采用PCR方法自PA01基因組擴增AmpDh3目的基因片段，擴增步驟 如下：
[0069] 1)設計PCR引物如下，分別為SEQ ID N0:3-4(下劃線示酶切位點堿基序列） 「00701
[0071] 2) -80 °C冷凍庫中取出保存的銅綠假單胞菌菌株ΡΑ01涂布于LB固體培養基上，于 37 °C培養過夜，再挑取單菌落接種于LB液體體培養基中培養8個小時，參照細菌基因組抽提 試劑盒抽提PA01基因組。
[0072] 3)以PA01全基因組DNA為模板PCR擴增AmpDh3全長基因
[0073] PCR 體系：
[0074]
[0075]
[0076] ?0財廣增反應條件98°(：預變性51^11，98°(：變性308,55°(：退火308,72°(：延伸908,30 個循環，72°C完全延伸6min。反應完畢后使用1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增結果，PCR擴增 結果示于圖1中。
[0077] 4)使用凝膠回收試劑盒回收AmpDh3PCR產物。
[0078] 3.PCR產物的鑒定與克隆，步驟如下：
[0079] l)BamH I和EcoR 頂每切pGEX-6P-2質粒和AmpDh3PCR產物
[0080] 酶切反應體系：
[0081]
[0082] 37Γ 酶切 2h。
[0083] 2)使用超薄回收試劑盒回收pGEX-6P-2質粒和經BamH I和EcoR頂每切的PCR產物。
[0084] 3)連接和轉化
[0085] 通過紫外分光光度計測定AmpDh3酶切回收產物核酸濃度：21ngAU，pGEX-6P-2酶 切回收產物核酸濃度:60ngAU。
[0086]連接反應體系：
[0087]
[0088] ~混勻，16°C連接 2h。
' '
[0089] 4)從-80°C冰箱取3管大腸桿菌XLlblue感受態細胞，第一管加入pGEX-6P-2質粒， 作陽性對照；第二管加入DNA連接產物;第三管不加外源DNA，作陰性對照。冰浴50min，42 °C 金屬浴中熱擊90s，迅速冰浴2min。加入600ul LB空白培養基，混勻，置于37°C搖床中220rp 振搖lh。
[0090] 各管以5000rpm室溫離心3min.，棄去300ul上清，再重懸菌體，取200μ1涂布于Amp 抗性LB平板。平板倒置于37 °C培養箱中培養24h。
[0091] 5)pGEX-6p-2-Vacll陽性重組質粒的篩選、鑒定
[0092]①陰性對照平板沒有菌落出現；陽性對照平板長滿菌落，說明感受態細胞制作正 確，結果可信。挑取轉化平板上分隔良好的菌落，接種于Amp抗性LB培養基中，37°C振蕩培養 過夜；
[0093] ②質粒抽提:參照質粒提取試劑盒說明書進行；
[0094] ③質粒DNA進行BamH I和EcoR I雙酶切；
[0095]雙酶切反應體系：
[0096]
[0097]
[0098] 37。(：酶切211;
[0099] ④1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切結果，結果如圖2,可見泳道2樣品為構建成功 的 pGEX-6p-2-Vacl 1 重組質粒；
[0100] ⑤pGEX-6p-2-Vacll重組質粒送往上海英俊公司測序，測序結果比GeneBank序列 信息比對，結果發現二者的序列核苷酸序列完全相同。
[0101] 實施例2:重組融合蛋白Vacll在原核表達系統一大腸桿菌中誘導表達及表達形式 的鑒定
[0102] 1. Vacll 誘導表達
[0103] 取過夜培養的pGEX-6P-2-Vacll/XL-lblue菌液 100Λ加入 10mL Amp+抗性的LB培 養基中，180rpm 37°C過夜培養，分別取過夜培養的菌液400yL加入20mL Amp+抗性的LB培養 基中（余下的菌液保存在4°C冰箱中備用），37°C培養2~3h，轉速200rpm，二次活化至0D600 為0.8-1.0時，加入1?16 4以1^，使其終濃度為20(^1，再置于搖床誘導表達30°(：誘導表達311。 [0104] 2)將誘導表達后的菌液取出，以12000rpm離心5min，棄去上清，加入lmL lysis buffer(20mM ΡΒ,ρΗ 7.2,250mM Nacl)混勻，超聲裂解3min(超聲6次30s/次），再4°C 14000rpm離心15min，分離上清和沉淀。
[0105] 2.處理上清
[0106] 取Glutathione Sepharose 4B 20μ1，用PBS洗滌3次后，將準備好的上清加入 Glutathione Sepharose 4Β中，室溫結合lh。在4°C下以 14000rpm離心3min后，使用PBS- 0.25%吐溫20洗滌2次，PBS洗滌一次。向結合后的Glutathione Sepharose 4B加入20yL 2 X蛋白質上樣buffer，煮沸5min，14000rpm離心3min〇
[0107] 3 ·處理沉淀
[0108] 在沉淀中加入500yL PBS重懸菌體，取80yL重懸菌液加入20yL 5X蛋白質上樣 buffer，煮沸 5min，14000rpm 離心 3min。
[0109] 4.SDS-PAGE 電泳
[0110] 將5%濃縮膠灌入制膠版中，在加入蒸餾水將膠壓平，室溫放置30min使其凝固，將 上層的蒸餾水倒干，再灌入10%分離膠，立即插上梳子，室溫放置30min使其凝固備用。將處 理好的上清和沉淀分別取10yL上樣，進行SDS-PAGE電泳。電壓先80v電泳30min，再調至 180v，電泳1~2h后，將膠取出，置于考馬斯亮藍染色液中振蕩染色，再置于脫色液中振蕩脫 色后，在呈像系統下觀察結果，PGEX-6P-2-Vacll/XL-lblue在30°C為可溶性蛋白（圖3)。
[0111] 實施例3:Vacll抗原的制備
[0112] 1.放大培養獲取蛋白
[0113] 取保存在4°C冰箱中備用的pGEX-6P-2-Vacll/XL-lblue菌液400yL加入到20mL含 Amp抗性的LB培養基中進行一次活化，200rpm 37°C培養5~6h后，取8mL-次活化的菌液加 入到400mL含Amp抗性的LB培養基中進行二次活化，37 °C培養3~4h至0D600為1.0時，加入80 yL IPTG(終濃度為200μΜ)置于16°C搖床中過夜誘導后，12000rpm離心15min收集菌體，再加 20mL lysis buffer(同實施例2)重懸菌體后，將菌液進行超聲裂解3min(200V)，收集上清 與800yL用于結合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B(GE公司）凝膠珠(beads)結合 處理;再進行SDS-PAGE凝膠電泳。
[0114] 2.使用酶切方法，將目的蛋白和GST標簽分開，獲取Vacl 1目的蛋白
[0115] 向余下約800yL已結合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800yL PBS(取 PBS(1L/袋）1袋加 I級水溶解完全并加 I級水定容至1L)和120yL PreScission protease(PP 酶，GE公司），室溫垂直旋轉酶切5h后，離心吸取上清后，分別用800yL PBS洗滌3次，各后取 l〇yL樣品變性處理后，上樣5yL進行蛋白電泳(方法同上），在呈相系統下觀察結果，酶切下 來的Vacl 1蛋白分子量在~30kDa，與預期蛋白分子量大小相符合，見圖4。
[0116] 實施例4重組融合蛋白Vacl 1的純化
[0117] 4.1高壓破菌、離心
[0118] 將上述表達可溶性銅綠假單胞菌重組亞單位基因工程蛋白Vacll的大腸桿菌工程 菌，通過高密度發酵，離心收集菌體備用，
[0119] 菌體400g左右以PBS(10mM，pH7 · 0-7 · 5)緩沖液，按重量:體積比1:10比例混勻懸 浮，4°C預冷。
[0120] 高壓勻漿機:使用蒸餾水沖洗高壓勻漿機管道，開啟低溫循環系統預冷至1-4°C備 用。
[0121 ]將預冷的懸浮菌液加入高壓勻漿機中，壓力維持在60_80Mpa破菌3-5次，取破菌液 涂片進行結晶紫染色，在油鏡每個視野下未破碎菌小于1-2個視為破菌完全。
[0122] 高速離心:破菌后的液體裝入離心桶，4°C，10，000-15,00(^離心15-30111；[11，收集上 清備用。
[0123] 4.2 GST親和純化
[0124] 選擇GST親和層析填料進行初步純化，GST親和填料為Glutathione Sepharose 4B、Glutathione Sepharose 4FF、Glutathione Sepharose HP之一，破菌菌體濕重每lOOg 填料用量為100ml。
[0125] Prescission Protease酶(PP酶)進行酶切洗脫:所使用的PP酶帶有GST標簽，以利 于去除PP酶，獲取目的蛋白，電泳結果如圖8所示。經過GST初純，目的蛋白的純度進一步提 尚，但仍有待提尚。
[0126] 4.3 Q HP層析純化
[0127] 收集實施例4.2的樣品，使用4液(20禮恥2冊〇4-似!^〇4 411?!17.〇-7.5)平衡層析 系統及Q HP層析柱，B液（20mM Na2HP〇4_NaH2P〇4，lM似(：1，？!17.0-7.5)線性梯度洗脫，設定 洗脫流速15ml/min，洗脫梯度為B液從0到100%，洗脫體積為500ml，收集洗脫下來的目的蛋 白保存在4 °C備用。層析圖如圖5所示，電泳結果如圖8所示。
[0128] A緩沖液的配制：（取Na2HP〇4.12H204.5g，NaH2P〇4.2H 200.5g，加 I級水900ml溶解完 全，調pH值至7.0-7.5,加 I級水定容至1L)。
[0129] B緩沖液的配制：（取Na2HP〇4· 12H204 · 5g，NaH2P〇4 · 2H200 · 5g，NaC158 · 5g