一種提高pcr特異性的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種提高PCR特異性的方法。
【背景技術】
[0002] PCR是一種體外選擇性擴增DNA的技術，每次擴增都以上一次擴增的產物作模板， 目標產物在幾小時內增加數百萬倍。雖然PCR非常敏感，但是很多因素會影響PCR的擴增效 率，如引物序列、模板DNA的GC含量、Mg 2+濃度、退火溫度等。為了克服PCR容易產生非特異性 產物的局限性，納米材料被用作添加劑來改善PCL2005年首次發現金納米粒子能提高PCR 的產量及特異性（AngewandteChemie International Edition,2005,44:5100-5103)。此后 發現量子點（Biochimie，2009 · 91:969-973)、碳納米材料(Nanotechnology，2004，15:154-157)、聚合物納米粒子(ACS applied materials&interfaces，2015，7:13142-13153)等對 PCR都有一定的改善。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種提高PCR特異性的方法。
[0004] 本發明的具體技術方案如下：
[0005] -種提高PCR特異性的方法，在PCR反應體系中添加聚合物修飾的氧化石墨烯來進 行反應，使得經過二至三輪的PCR，產物仍然能保持特異性，該聚合物修飾的氧化石墨烯在 PCR反應體系中的終濃度為0.6~38.4yg/mL，上述聚合物為聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙二 醇或聚磺基甜菜堿。
[0006] 在本發明的一個優選實施方案中，所述聚合物為聚丙烯酸，所述聚合物修飾的氧 化石墨烯在PCR反應體系中的終濃度為0.6~2.4yg/mL。
[0007] 在本發明的一個優選實施方案中，所述聚合物為聚丙烯酰胺，所述聚合物修飾的 氧化石墨稀在PCR反應體系中的終濃度為2.4~9.6yg/mL。
[0008] 在本發明的一個優選實施方案中，所述聚合物為聚乙二醇，所述聚合物修飾的氧 化石墨烯在PCR反應體系中的終濃度為4.8~19.2yg/mL。
[0009] 在本發明的一個優選實施方案中，所述聚合物為聚磺基甜菜堿，所述聚合物修飾 的氧化石墨稀在PCR反應體系中的終濃度為4.8~38.4yg/mL。
[0010] 進一步優選的，所述聚合物修飾的氧化石墨稀的制備方法如下：取0.8~1.2mg/mL 氧化石墨烯45~55mL和0.8~1.2g丙烯酸單體混合均勻，通氮氣以除去溶液中的殘留的氧， 繼而加入75~85mg過硫酸銨，同時加熱到68~72°C反應2.5~3.5h，反應結束后冷卻到室 溫，加入180~220mL水進行稀釋，超聲1~1.3h，透析以除去未接上氧化石墨稀的聚丙稀酸， 離心收集固體，真空干燥后，即得所述聚合物修飾的氧化石墨烯。
[0011 ]進一步優選的，所述聚合物修飾的氧化石墨稀的制備方法如下:取0.8~1.2mg/mL 氧化石墨烯45~55mL和0.8~1.2g丙烯酰胺單體混合均勻，通氮氣以除去溶液中的殘留的 氧，繼而加入75~85mg過硫酸銨，同時加熱到68~72°C反應2.5~3.5h，反應結束后冷卻到 室溫，加入180~220mL水進行稀釋，超聲1~1.3h，透析以除去未接上氧化石墨稀的聚丙稀 酰胺，離心收集固體，真空干燥后，即得所述聚合物修飾的氧化石墨烯。
[0012]進一步優選的，所述聚合物修飾的氧化石墨稀的制備方法如下：取10mL 3M的NaOH 加入45~55mL 0.8~1.2mg/mL的氧化石墨稀中，超聲反應2.5~3.5h，然后加入一定量的 HC1中和過量的NaOH至中性，繼而過濾水洗，并重新分散到水中，加入1.8~2.2mg/mL氨基修 飾的PEG超聲反應4~5min后加入4.5~5.5mM的EDC繼續超聲25~40min，最后再加入足量 EDC至20mM攪拌過夜，離心取上清即得所述聚合物修飾的氧化石墨稀，上述氨基修飾的PEG 的結構式）
且分子量為4000~6000。
[0013]進一步優選的，所述聚合物修飾的氧化石墨稀的制備方法如下：取0.8~1.2mg/mL 氧化石墨烯45~55mL，0.8~1.2g磺基甜菜堿單體，通氮氣以除去溶液中的殘留的氧，繼而 加入75~85mg過硫酸鉀，同時加熱到63~67°C反應13~17h，反應結束后冷卻到室溫，透析 至除去未接上氧化石墨烯的聚磺基甜菜堿，離心取上清即得所述聚合物修飾的氧化石墨 稀。
[0014] 本發明的有益效果是:本發明的方法在PCR反應體系中添加聚合物修飾的氧化石 墨烯，可以顯著增強PCR反應的特異性。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發明實施例1制備的各種聚合物修飾的氧化石墨烯的原子力顯微鏡照片。
[0016] 圖2為本發明實施例2的實驗結果對比圖。
[0017] 圖3為本發明實施例3的實驗結果對比圖。
【具體實施方式】
[0018] 以下通過【具體實施方式】結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。
[0019] 實施例1
[0020] 聚合物修飾的氧化石墨烯的制備：
[0021] (1)聚丙稀酸修飾的氧化石墨稀(G0-PAA)的制備:取1.0mg/mL GO 50mL，lg丙稀酸 單體，通氮氣30min以除去溶液中的殘留的氧，繼而加入80mg過硫酸銨，同時加熱到70 °C反 應3h，反應結束后冷卻到室溫，加入200mL水進行稀釋，超聲lh，透析一周，除去未接上石墨 烯的聚丙烯酸，離心收集固體，即得PAA修飾的GO(GO-PAA)，真空干燥箱干燥一夜備用。
[0022] (2)聚丙烯酰胺修飾的氧化石墨烯(G0-PAM)制備方法同上，只是用丙烯酰胺單體 替代了丙烯酸單體。
[0023] (3)聚乙二醇修飾的氧化石墨烯(GO-PEG)的制備：取1 OmL 3M的NaOH加入50mLG0溶 液，超聲反應3h，然后加入一定量的HC1中和過量的NaOH使溶液呈中性，繼而過濾水洗，并重 新分散到水溶液中，加入2mg/mL氨基修飾的TOG超聲反應5min，加入5mM的EDC繼續超聲 30min，最后再加入足量EDC至20mM攪拌過夜，低速離心取上清即得GO-PEG，上述氨基修飾的 PEG的結構式為％且分子量為4000~6000。
，.
[0024] (4)聚磺基甜菜堿修飾的石墨稀(GO-pSB)的制備:取1.0mg/mL GO 50mL，lg磺基甜 菜堿單體，通氮氣30min以除去溶液中的殘留的氧，繼而加入80mg過硫酸鉀，同時加熱到65 °C反應15h，反應結束后冷卻到室溫，透析一周，除去未接上石墨烯的聚磺基甜菜堿，低速離 心取上清即得GO-pSB。
[0025] 上述G0-PAA、GO-ΡΑΜ、GO-PEG和G〇-p SB分別如圖1的a、b、c和d所示，從圖中可以看 出，聚合物修飾的氧化石墨稀的尺寸不均一，其中G0-PAA的片層大小為300±23.5nm，厚度 在lnm左右；GO-ΡΑΜ片層大小為200±15.8nm，厚度在3nm左右 ；G0-PEG片層大小為150± 10 · 2nm，厚度在lnm左右;G〇-pSB片層大小為200 ± 28 · 6nm，厚度在4nm左右。
[0026] 實施例2
[0027] 本實施例的PCR反應體系如下表所示：
[0028]
[0029] 擴增程序為：（1)94°C 預變性 5min;(2)94°C 變性 30s;(3)60°C 退火 30s;(4)72°C 延 伸90s;(5)72°C延伸10min。其中2-4步循環31次，上述F1的序列如SEQID 01所示，上述F2的 序列如SEQ ID 02所示。
[0030] 上述反應體系的目標產物為689bp，在上述體系中加入聚合物修飾的氧化石墨烯 至相應的終濃度，PCR程序結束后擴增后的產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠用溴化乙 錠(Ethidium Bromide，EB)染色，在150V條件下電泳約30min，在凝膠成像系統下拍照，具體 結果如圖2所不。
[0031] 圖2中，Μ為DL-2000DNA marker; (a)、（b)分別為G〇-PAA、G〇-PAM加入PCR體系后的 第一輪的擴增結果，泳道1-8中加入的材料的量依次為0,0.8，1.6，2