.4，4.8,6.4，8.0,9.6μ g/mL; (c)、（ d)分別為GO-PEG和G〇-pSB加入PCR體系后的第一輪的擴增結果，泳道1 -6中加入 的材料的量依次為〇，4.8,9.6，14.4，19.2and 24.0yg/mL。第一輪中無論是對照還是加入材 料后均無彌散及拖尾現象，說明有很好的特異性。加入少量G0-PAA對反應沒有影響，當加入 的濃度超過3.2yg/mL時，反應被完全抑制，而對于G〇-PAM、G〇-PEG和G0-PSB，這一抑制濃度 分別是6.4yg/mL、19.2yg/mL和24yg/mL。因此可以得出，四種功能化石墨稀對于PCR的抑制 強度分別是:G〇-PAA>G〇-PAM>G〇-PEG>G〇-pSB。
[0032] 圖2中，（6)、（〇、（8)、和(10是第二輪?〇?反應的結果，濃度與第一輪相對應，其中 所用模板為第一輪反應中相應泳道的產物。如圖所示，對照組開始出現大量非特異性產物， G〇-PAA、G〇-PAM的加入對非特異性產物有一定的抑制效果，而G〇-PEG、G〇-pSB需要加入較多 的材料才能達到效果。
[0033] 實施例3
[0034] 本實施例的PCR反應體系如下表所示：
[0035]
[0036] 擴增程序為：（1)94°C預變性 5min;(2)94°C變性 30s;(3)60°C退火 30s;(4)72°C延 伸90s;(5)72°C延伸lOmin。其中2-4步循環31次，上述709F5的序列如SEQ ID 03所示，上述 709R4的序列如SEQ ID 04所示。
[0037]上述反應體系的目標產物為324bp，在上述體系中加入聚合物修飾的氧化石墨烯 至相應的終濃度，PCR程序結束后擴增后的產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠用溴化乙 錠(Ethidium Bromide，EB)染色，在150V條件下電泳約30min，在凝膠成像系統下拍照，具體 結果如圖3所不。
[0038] 圖3中，Μ為DL-2000DNA marker; (a)為GO-PAA加入PCR體系后的第一輪的擴增結 果，泳道1-5中加入的材料的量依次為0，0.6，1.2，1.8,2.4yg/mL; (b)為GO-ΡΑΜ加入PCR體系 后的第一輪的擴增結果，泳道1-5中加入的材料的量依次為0，2.4,4.8,7.2,9.6yg/mL; (c) 為GO-PEG加入PCR體系后的第一輪的擴增結果，泳道1 -5中加入的材料的量依次為0，4.8， 9.6，14.4，19.2以8/1^;((1)為60-?38加入?〇?體系后的第一輪的擴增結果，泳道1-5中加入的 材料的量依次為〇，9.6，19.2，28.8，38.4yg/mL。如圖所示，第一輪中無論是對照還是加入材 料后均無彌散及拖尾現象，說明有很好的特異性。根據DNA marker所示，條帶大小均在 324bp位置，說明加入材料后也不影響模板與引物的精準配對。如圖（a)所示，加入少量G0-PAA對反應沒有影響，當加入的濃度超過2.4yg/mL時，產物明顯減少，而對于G〇-PAM、G〇-PEG 和G0-PSB，條帶消失濃度分別是4.8yg/mL、14.4yg/mL和38.4yg/mL。因此可以得出，四種功 能化石墨烯對于PCR的抑制強度依然是這種趨勢，分別是:G〇-PAA>G〇-PAM>G〇-PEG>G〇-pSB。
[0039] 圖3中，（e)、（f)、（g)、和(h)是第二輪PCR反應的結果，其中反應濃度與第一輪相對 應，所用模板為第一輪反應中相應泳道的產物。如圖所示，跟第一輪結果基本一致，還沒有 出現拖尾現象。
[0040] 圖3(1)、（」）、（10、和（1)是第三輪?〇?反應的結果，其中反應濃度與第一輪相對應， 其中所用模板為第二輪反應中相應泳道的產物。如圖所示，對照組開始出現大量非特異性 產物，G〇-PAA、G〇-PAM的加入對非特異性產物有一定的抑制效果，而G〇-PEG、G〇-pSB需要加 入較多的材料才能達到增強特異性的效果。
[0041] 以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的范圍，即 依本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。
【主權項】
1. 一種提高PCR特異性的方法，其特征在于:在PCR反應體系中添加聚合物修飾的氧化 石墨締來進行反應，使得經過二至S輪的PCR，產物仍然能保持特異性，該聚合物修飾的氧 化石墨締在PCR反應體系中的終濃度為0.6~38.4iig/mL，上述聚合物為聚丙締酸、聚丙締酷 胺、聚乙二醇或聚橫基甜菜堿。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚合物為聚丙締酸，所述聚合物修飾的 氧化石墨締在PCR反應體系中的終濃度為0.6~2.化g/mL。3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚合物為聚丙締酷胺，所述聚合物修飾 的氧化石墨締在PCR反應體系中的終濃度為2.4~9.化g/mL。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚合物為聚乙二醇，所述聚合物修飾的 氧化石墨締在PCR反應體系中的終濃度為4.8~19.2iig/mL。5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚合物為聚橫基甜菜堿，所述聚合物修 飾的氧化石墨締在PCR反應體系中的終濃度為4.8~38.化g/mL。6. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述聚合物修飾的氧化石墨締的制備方 法如下：取O .8~1.2mg/mL氧化石墨締45~55mL和0.8~1.2g丙締酸單體混合均勻，通氮氣 W除去溶液中的殘留的氧，繼而加入75~85mg過硫酸錠，同時加熱到68~72°C反應2.5~ 3.5h，反應結束后冷卻到室溫，加入180~220mL水進行稀釋，超聲1~1.化，透析W除去未接 上氧化石墨締的聚丙締酸，離屯、收集固體，真空干燥后，即得所述聚合物修飾的氧化石墨 締。7. 如權利要求1或3所述的方法，其特征在于:所述聚合物修飾的氧化石墨締的制備方 法如下：取0.8~1.2mg/mL氧化石墨締45~55mL和0.8~1.2g丙締酷胺單體混合均勻，通氮 氣W除去溶液中的殘留的氧，繼而加入75~85mg過硫酸錠，同時加熱到68~72°C反應2.5~ 3.5h，反應結束后冷卻到室溫，加入180~220mL水進行稀釋，超聲1~1.化，透析W除去未接 上氧化石墨締的聚丙締酷胺，離屯、收集固體，真空干燥后，即得所述聚合物修飾的氧化石墨 締。8. 如權利要求1或4所述的方法，其特征在于:所述聚合物修飾的氧化石墨締的制備方 法如下：取1〇1111^31的化0助日入45~551111^0.8~1.2111旨/1]^的氧化石墨締中，超聲反應2.5~ 3.5h，然后加入一定量的HCl中和過量的化OH至中性，繼而過濾水洗，并重新分散到水中，加 入1.8~2.2mg/mL氨基修飾的陽G超聲反應4~5min后加入4.5~5. SmM的抓C繼續超聲25~ 40min，最后再加入足量抓C至20mM攬拌過夜，離屯、取上清即得所述聚合物修飾的氧化石墨締，上述氨基修飾的PEG的結構式為 且分子量為 ，' 4000~6000。9. 如權利要求1或5所述的方法，其特征在于:所述聚合物修飾的氧化石墨締的制備方 法如下：取0.8~1.2mg/mL氧化石墨締45~55血，0.8~1.2g橫基甜菜堿單體，通氮氣W除去 溶液中的殘留的氧，繼而加入75~85mg過硫酸鐘，同時加熱到63~67 °C反應13~17h,反應 結束后冷卻到室溫，透析至除去未接上氧化石墨締的聚橫基甜菜堿，離屯、取上清即得所述 聚合物修飾的氧化石墨締。
【專利摘要】本發明公開了一種提高PCR特異性的方法，在PCR反應體系中添加聚合物修飾的氧化石墨烯來進行反應，使得經過二至三輪的PCR，產物仍然能保持特異性，該聚合物修飾的氧化石墨烯在PCR反應體系中的終濃度為0.6～38.4μg/mL，上述聚合物為聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙二醇或聚磺基甜菜堿。本發明的方法在PCR反應體系中添加聚合物修飾的氧化石墨烯，可以顯著增強PCR反應的特異性。
【IPC分類】C08G73/00, C08F220/06, C12N15/10, C08F220/56, C08G83/00, C08F292/00
【公開號】CN105647909
【申請號】
【發明人】孫莉萍, 鐘勇, 熊云景
【申請人】廈門大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月25日