結晶干燥后，獲得三磷酸腺苷干品
0.62kg，純度 99.5%。
[0076]實施例7固定化ATP生產酶制備三磷酸腺苷
[0077]按實施例2制備固定化ATP生產酶。在200L反應罐中配制總體積100L的反應液，含AMP 2mM，含三聚磷酸鈉4mM(以磷酸根計)，含氯化鎂150mM(以鎂離子計)，余量為水。使用NaOH調節反應液的pH至10.0。加入上述固定化ATP生產酶0.5kg(5g/L)，在25°C下150rpm開始攪拌反應，反應20h后，經高效液相色譜(HPLC)檢測，ATP的生成量約為0.5mM，其中25%AMP轉化為ATP。反應后的溶液經濾袋回收固定化ATP生產酶，透過液經層析分離結晶干燥后，獲得三磷酸腺苷干品20g，純度99.2 %。
[0078]實施例8固定化ATP生產酶制備三磷酸腺苷
[0079]按實施例1分別制備高表達Ppk、Adk菌株，經發酵完成后離心收集菌體。分別取含Ppk的菌體1.0kg，含Adk的菌體0.2kg，用4L 0.1M pH7.5Tris鹽酸緩沖液混溶懸浮后，用高壓均質機破碎菌，離心收集上清即得ATP生產酶。
[0080]取聚乙稀醇0.8kg、卡拉膠0.04kg，加入8L純水混勾后在110 °C下保溫20min至全部溶化，取出后置37 0C水浴保溫，加入上述4LATP生產酶混合均勻，之后將混合液緩慢加入KCl飽和硼酸溶液中，制成球狀顆粒。用0.02M pH7.0磷酸鹽緩沖液清洗2遍，即得固定化ATP生產酶。
[0081]將該酶用磷酸緩沖液混懸后裝入中壓玻璃柱，制得酶反應柱。酶反應柱包括玻璃柱、頂部緊固件、下部緊固件，500目篩網。柱內徑3.5cm，柱高100cm。柱體積960mL，裝酶量800mLo
[0082]配制2000ml底物反應液，反應液含60mMAMP，含800mM三聚磷酸鈉(磷酸根計)，20mM氯化鎂，用NaOH調節反應液pH至7.5。用恒流栗將底物反應液以500mL/h流量通過酶反應柱，350C下進行反應，反應3h取樣測定AMP的轉化率為60%。收集反應液，并用200ml純水置換柱中殘留的反應液。反應液經層析分離結晶干燥后，獲得ATP干品30g，純度99.0 %。
[0083]實施例9固定化ATP生產酶制備三磷酸腺苷
[0084]按實施例2制備ATP生產酶。
[0085]固定化載體處理:取280g殼聚糖溶于4.5LI %甲酸溶液，在40°C水浴中攪拌Ih過濾，濾液中加硅膠4.2kg，室溫振蕩過夜，水洗三次，加4.2 %的戊二醛水溶液8.0L，室溫振蕩3h，抽濾水洗三次，60 0C烘箱中干燥4h得固定化載體。取上述處理后固定化載體4.2kg與上述ATP生產酶20L混合，在4°C條件下，震蕩12h。過濾收集載體，用0.02M pH 8.0磷酸鉀緩沖液清洗2遍，即得固定化ATP生產酶。
[0086]在200L反應罐中配制總體積100L的反應液，含AMP 40mM，含多磷酸鈉(由35個磷酸根聚合)750mM(以磷酸根計)，含氯化鎂25mM(以鎂離子計)，含硫酸錳0.5g/L、含磷酸二氫鈉2g/L，余量為水。初始用NaOH調節反應液pH至5.5，繼續用Tris調節反應液的pH至8.0。加入上述固定化ATP生產酶4kg，在37 °C下攪拌反應，反應5h后，經HPLC檢測ATP的生成量約為30mM，其中75 % AMP轉化為ATP。反應后的溶液經濾袋回收固定化ATP生產酶，透過液經層析分離結晶干燥后，獲得三磷酸腺苷干品1.4kg，純度99.3%。
[0087]實施例10固定化ATP生產酶制備三磷酸腺苷
[0088]按實施例1分別制備高表達Pap、Ppk、Adk菌株，經發酵完成后分別收集菌體。取含Pap的菌體0.4kg，用2L 0.1M pH7.5磷酸鉀溶液混懸后，用高壓均質機破碎菌，離心收集上清。在上清酶液中加入含氨基合成高聚物LX1000HA載體0.5kg在4°C條件下，150rpm攪拌8h。過濾收集載體，用0.02M pH 8.0磷酸鉀緩沖液清洗2遍，即得固定化Pap酶。按相同的方法制備固定化Ppk酶、固定化Adk酶。將固定化Pap酶0.5kg、固定化Ppk酶0.5kg、固定化Adk酶0.2kg混合均勻即得固定化ATP生產酶。
[0089]在200L反應罐中配制總體積100L的反應液，含AMP 40mM，含二偏磷酸750mM(以磷酸根計)，含氯化鎂25mM(以鎂離子計)，含氯化鉀1mM(以鉀離子計)。攪拌下用NaOH調節反應液的pH至7.5 ο分別加入上述固定化ATP生產酶，在37°C下攪拌反應，反應8h后，經HPLC檢測ATP的生成量約為28mM，其中70 % AMP轉化為ATP。反應后的溶液經濾袋回收固定化ATP生產酶，透過液經層析分離結晶干燥后，獲得三磷酸腺苷干品1.25kg，純度99.3%。
[0090]本發明采用新型的Ppk、Adk、Pap三種ATP生產酶，只需兩步酶促反應即可合成ATP。與傳統啤酒酵母生產ATP繁瑣的工藝過程相比，反應過程更簡單，反應更容易控制，產品質量更加穩定;采用固定化酶催化的方法制備ATP，固定化酶可連續、反復多次使用，大幅的降低了生產成本，同時避免了使用酵母引入的大量蛋白、色素等雜質，更加易于純化;建立了適用于大規模生產ATP的間歇攪拌反應及酶反應柱連續反應體系。
[0091]雖然本發明已以實施例公開如上，然其并非用于限定本發明，任何本領域技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，均可作各種不同的選擇和修改，因此本發明的保護范圍由權利要求書及其等同形式所限定。
【主權項】
1.一種固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將ATP生產酶固定于固定化載體上，制備固定化ATP生產酶； (2)利用固定化ATP生產酶，催化制備三磷酸腺苷反應液；以及 (3)分離產物三磷酸腺苷(ATP)。2.根據權利要求1所述的固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述固定化載體選自于高分子載體、無機載體和磁性高分子微球載體中的一種或多種組合。3.根據權利要求2所述的固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述高分子載體選自于纖維素、葡萄糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸鈉、殼聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明膠、卡拉膠、尼龍、合成高聚物的一種或多種組合;所述無機載體選自于多孔玻璃、氧化硅、活性炭、硅膠和硅藻土的一種或多種組合。4.根據權利要求2所述的固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述ATP生產酶通過吸附、包埋、共價、結合、交聯或其組合的方式固定于固定化載體;所述固定化載體與所述ATP生產酶的質量比為1:1-150:1。5.根據權利要求1所述的固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述步驟(2)催化制備三磷酸腺苷反應液的反應條件為: 反應溫度為25-60 °C; 反應pH為5-10的條件下； 反應體系包括以下底物和離子:聚磷酸類化合物和鎂離子； 在反應體系中添加AMP或ADP，利用固定化ATP生產酶催化反應生成ATP反應液。6.根據權利要求1、4或5所述的固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述ATP生產酶選自于多聚磷酸激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸轉移酶(Pap)的任意兩種或三種的組合。7.根據權利要求5所述的固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述反應體系還包含以下離子:銨離子、錳離子、鉀離子、鈉離子、Tris和磷酸根離子的一種或多種組入口 ο8.根據權利要求5所述的固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述聚磷酸類化合物選自于多聚偏磷酸或其鹽、多聚磷酸或其鹽的一種或多種組合。9.根據權利要求5或7所述的固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述催化反應為在反應罐中添加固定化ATP生產酶、AMP或ADP、底物和離子進行攪拌反應;或是將固定化ATP生產酶裝入酶反應柱中，將AMP或ADP、底物和離子通過酶反應柱進行間歇或連續反應。10.根據權利要求5所述的固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述反應體系中AMP或ADP的濃度為2mM-80mM、聚磷酸類化合物濃度為4mM-lM、鎂離子濃度為2mM-200mM、固定化ATP生產酶的添加量為5-200g/L。
【專利摘要】本發明公開了一種固定化酶法制備三磷酸腺苷的方法，包括以下步驟：(1)將ATP生產酶固定于固定化載體上，制備固定化ATP生產酶；(2)利用固定化ATP生產酶，催化制備三磷酸腺苷反應液；以及(3)分離產物三磷酸腺苷(ATP)。本發明采用新型Ppk、Adk、Pap三種ATP生產酶，只需兩步酶促反應即可合成ATP，反應過程更簡單，反應更容易控制，產品質量更加穩定；采用固定化酶催化的方法制備ATP，固定化酶可連續、反復多次使用，大幅的降低了生產成本。同時避免了使用酵母引入的大量蛋白、色素等雜質，更加易于純化；建立了適用于大規模生產ATP的間歇攪拌反應及酶反應柱連續反應體系。
【IPC分類】C12N11/08, C12P19/32, C12N11/12, C12N11/10
【公開號】CN105647996
【申請號】
【發明人】于鐵妹, 劉珊珊, 黃慶軍, 秦永發
【申請人】深圳市古特新生生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月22日