據下列基因的序列，設計三對擴增引物，由中美泰和生物技術有限公司合成，弓丨物序列如下:
[0045]ppk正義引物:5，-CCATATGGGTCAGGAAAAGCTATACATCG-3，；
[0046]ppk反義引物:5，-CGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGATT-3，；
[0047]adk正義引物:5，-CCATATGCGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3，；
[0048]adk反義引物:5，-CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3，；
[0049]pap正義引物:5’ -GCCATGGATACAGAAACGATCGCCAGTGCAG-3’ ；和
[0050]pap反義引物:5 ’ -CGGATCCTTAATCCGTGTCGCGATCCGCTT-3 ’ ；
[°°511 提取大腸桿菌(Escherichia coli)K12菌株(購于天根生化科技有限公司)DNA，以其為模板，通過PCR擴增出ppk與adk基因片段，并將其分別連接至pET 22b載體(購于Invitrogen公司)；提取約氏不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)菌株(CGMCC 1.8030)DNA，以其為模板，通過PCR擴增出pap基因片段，并將其連接至pET 22b載體(購于Invitrogen公司)。三段連接序列經測序正確后，分別轉入E.coli BL21 (DE3)菌株(購于天根生化科技有限公司)。
[0052]將轉化后的E.coliBL21(DE3)單克隆接入LB培養基，培養至對數期后，加入ImM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導5小時后，收集菌體，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)篩選高表達菌株。
[0053]將篩選出的高表達菌株在無菌條件下接入種子培養基，培養至對數生長期后接入含5L發酵培養基的發酵罐中，培養至對數生長期后接入含50L發酵培養基的發酵罐中，培養5小時后加入ImM IPTG誘導5小時后，離心收集菌體約100g。
[0054]其中LB培養基成分為:I%蛋白胨、0.5 %酵母粉和I % NaCl;種子培養基成分為:1%蛋白胨、0.5%酵母粉和1%氯化鈉;發酵培養基成分為:1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化鈉、5 %磷酸氫二鈉、I %磷酸二氫鈉、0.01 %硫酸鎂和I %甘油。
[0055]圖1為所制備酶的SDS-PAGE圖，如圖所示:泳道I為蛋白標志物14.4-116kDa(購于北京中科瑞泰生物技術有限公司);泳道2為Ppk酶，約60kDa ；泳道3為Adk酶，約24kDa ；泳道4為Pap酶，約 56kDa。
[0056]實施例2固定化ATP生產酶制備三磷酸腺苷
[0057]按實施例1分別制備高表達Ppk、Pap菌株，經發酵完成后離心收集菌體。分別取含Pap的菌體2.0kg，含Ppk的菌體2.0kg，用20L 0.1M pH7.5Tris鹽酸緩沖液混溶懸浮后，用高壓均質機破碎菌，離心收集上清即得ATP生產酶。
[0058]在恒溫攪拌反應罐中加入含氨基合成高聚物載體LX1000HA5kg與上述ATP生產酶20L混合(折合固定化載體與酶質量比為25:1)，在20°C條件下，150rpm攪拌12h。過濾收集載體，用0.02M pH 8.0磷酸鉀緩沖液清洗2遍，即得固定化ATP生產酶。
[0059]在200L反應罐中配制總體積100L的反應液，含AMP 40mM，含六偏磷酸0.75M(以磷酸根計)，含硫酸鎂25mM(以鎂離子計)，余量為水。使用NaOH調節反應液的pH至7.0。加入上述固定化ATP生產酶5kg(50g/L)，在37°C下150rpm開始攪拌反應，反應5h后，經高效液相色譜(HPLC)檢測ATP的生成量約為36mM，其中90%AMP轉化為ATP APLC檢測條件為:KromasilC18色譜柱(購于AKZO NOBEL公司)(150 X 4.6mm)，檢測波長21nm。流動相為含有6.8g/L磷酸二氫鉀、2.0g/L庚烷磺酸鈉和3%甲醇的水溶液，pH=2.0。反應后的溶液經濾袋回收固定化ATP生產酶，透過液經層析分離結晶干燥后，獲得三磷酸腺苷干品1.7kg，純度99.5%。
[0060]將回收固定化ATP生產酶置于30°C條件下恒溫，每天取一定量測定酶活，連續考察10天，以第一天固定化酶活為基準，考察酶活穩定性。第10天時，活性為第一天的70%。
[0061 ]實施例3固定化ATP生產酶制備三磷酸腺苷
[0062]按實施例1分別制備高表達Pap、Adk菌株，經發酵完成后離心收集菌體。分別取含Pap的菌體1.6kg，含Adk的菌體0.4g，用2OL磷酸緩沖液混溶懸浮后，用高壓均質機破碎菌，離心收集上清，即得ATP生產酶液。
[0063]在恒溫攪拌反應罐中加入含環氧基聚丙烯酸載體4kg與16L上述ATP生產酶液混合(折合固定化載體與酶蛋白質量比為40:1)。在25°C條件下，150rpm攪拌5h。過濾收集載體，用0.0lM pH 8.0磷酸鉀緩沖液清洗2遍。將固定化ATP生產酶置于50mM甘氨酸溶液中30min，再用0.0lM pH 8.0磷酸鉀緩沖液清洗2遍即得固定化ATP生產酶。
[0064]在200L反應罐中配制總體積100L的反應液，含AMP 40mM，含六偏磷酸鈉750mM(以磷酸根計)，含氯化鎂25mM(以鎂離子計)。攪拌下用KOH調節反應液的pH至7.5。加入上述固定化ATP生產酶4kg(40g/L)，在37 °C下攪拌反應，反應5h后，經HPLC檢測ATP的生成量約為28mM，其中70 % AMP轉化為ATP。反應后的溶液經濾袋回收固定化ATP生產酶，透過液經層析分離結晶干燥后，獲得三磷酸腺苷干品1.3kg，純度99.3 %。按實施例2的方法考察回收酶的酶活穩定性，第10天時，酶活性為第一天的75 %。
[0065]實施例4固定化ATP生產酶制備三磷酸腺苷
[0066]按實施例1分別制備高表達Ppk、Adk菌株，經發酵完成后離心收集菌體。分別取含Pap的菌體8.0kg，含Adk的菌體4.0kg，用60L磷酸緩沖液混溶懸浮后，用高壓均質機破碎菌，離心收集上清，即得ATP生產酶液。
[0067]取上述ATP生產酶液60L，加入0.6kg含羧基的纖維素固定化載體(折合固定化酶載體與酶蛋白質量比為1:1)，攪拌進行固定化，獲得固定化ATP生產酶。
[0068]在200L反應罐中配制總體積100L的反應液，含ADP 40mM，含四聚磷酸鈉0.75M(以磷酸根計)，含七水硫酸鎂25mM(以鎂離子計)，含硫酸銨1mM(以銨離子計)、含氯化鉀20mM(以鉀離子計)。攪拌下用NaOH調節反應液的pH至8.0。加入上述固定化ATP生產酶0.6kg(6g/L)，在370C下攪拌反應，反應12h后，經HPLC檢測三磷酸腺苷的生成量約為26mM，其中65 %ADP轉化為ATP。反應后的溶液經濾袋回收固定化ATP生產酶，透過液經層析分離結晶干燥后，獲得三磷酸腺苷干品1.1kg，純度99.2%o按實施例2的方法考察回收酶的酶活穩定性，第1天時，酶活性為第一天的72 %。
[0069]實施例5固定化ATP生產酶制備三磷酸腺苷
[0070]按實施例2制備固定化ATP生產酶，用磷酸緩沖液混懸后裝入中壓玻璃柱，制得酶反應柱。酶反應柱包括玻璃柱、頂部緊固件、下部緊固件，500目篩網。柱內徑3.5cm，柱高100011。柱體積96011^，裝酶量800111匕
[0071 ] 配制2000ml底物反應液，反應液含60mMAMP，含800mM三聚磷酸鈉(磷酸根計)，20mM氯化鎂，用NaOH調節反應液pH至7.5。用恒流栗將底物反應液以500mL/h流量通過酶反應柱，250C下進行反應，反應3h取樣測定AMP的轉化率為75%。收集反應液，并用200ml純水置換柱中殘留的反應液。反應液經層析分離結晶干燥后，獲得ATP干品43g，純度99.4 %。以同一酶反應柱相同的條件下連續反應3天，酶活仍為初始酶活的90%以上。
[0072]實施例6固定化ATP生產酶制備三磷酸腺苷
[0073]按實施例1分別制備高表達Ppk、Adk菌株，經發酵完成后離心收集菌體。分別取含Pap的菌體2.5kg，含Ppk的菌體0.125kg，用13L 0.IM pH7.5Tris鹽酸緩沖液混溶懸浮后，用高壓均質機破碎菌，離心收集上清即得ATP生產酶。
[0074]在恒溫攪拌反應罐中加入含氨基的瓊脂糖載體20kg與上述ATP生產酶13L混合(折合固定化載體與酶質量比為150:1)，在25°C條件下，150rpm攪拌5h。過濾收集載體，用0.02MPH 8.0磷酸鉀緩沖液清洗2遍，即得固定化ATP生產酶。
[0075]在200L反應罐中配制總體積100L的反應液，含AMP 80mM，含多聚磷酸鈉(由75個磷酸根聚合HM(以磷酸根計)，含硫酸鎂2mM(以鎂離子計)，余量為水。使用Tris調節反應液的pH至5.0 ο加入上述固定化ATP生產酶20kg( 200g/L)，在60 °C下150rpm開始攪拌反應，反應1h后，經高效液相色譜(HPLC)檢測ATP的生成量約為8mM，其中20%AMP轉化為ATP。反應后的溶液經濾袋回收固定化ATP生產酶，透過液經層析分離