一種從凝結芽孢桿菌中提取環(甘-酪)二肽的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于環(甘-酪)二肽的制備技術領域，具體涉及一種從凝結芽孢桿菌中提 取環(甘-酪)二肽的方法。
【背景技術】
[0002] 凝結芽孢桿菌(bacillus coagulans LL1103)，又稱芽孢乳酸菌，既擁有乳酸菌產 乳酸的特性，又具有芽孢桿菌的豐富的酶系統及抗逆性強、耐高溫、耐膽鹽、易儲存的特性。 作為益生菌家族的后起之秀，將其制成微生態制劑己被廣泛地應用于水產養殖、畜牧伺料、 食品和醫藥等行業。凝結芽孢桿菌除了在維持腸道微生態平衡中的保健作用外，其對常見 腸道疾病如慢性結腸炎、腹瀉和便秘等有明顯療效，還具有調節血糖血脂和提高免疫力的 功效。
[0003] 研究表明凝結芽孢桿菌代謝產物中具有抑制腐敗菌和致病菌的多肽類物質細菌 素，近年來還有關于凝結芽孢桿菌產生抗植物病原真菌的報道。但是凝結芽孢桿菌代謝產 物中卻未見小分子物質環二肽類化合物的報道，環二肽是一種具有穩定六元環結構的二酮 哌嗪類物質，表現出抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫抑制、神經保護、抗高血糖、抗瘧 疾等多種生物活性和藥理活性。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種制備工藝簡單、制得的環(甘-酪)二肽純度高的從凝結 芽孢桿菌中提取環(甘-酪)二肽的方法。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案是，一種從凝結芽孢桿菌中提取環(甘-酪)二肽的方法，環(甘-酪)二肽的結構式如下：
所述方法包括以下步驟： (1) 菌種活化:將凝結芽孢桿菌接種到平板培養基上，37 °C條件下培養24小時，獲得活 化菌種； (2) 初級培養:將步驟（1)中得到的活化菌種接種到MRS液體培養基中，在150r/min，37 °C條件下，搖床培養12~16小時，得種子液； (3) 次級培養:將步驟(2)得到的種子液接種到MRS液體培養基中，種子液的體積為MRS 液體培養基體積的4~6%，在150r/min，37 °C條件下，搖床培養48~72小時得發酵液； (4) 粗提物制備:將步驟(3)制備的發酵液旋蒸濃縮至原來體積的1/4后離心，取上清液 用乙醇沉淀，過濾并繼續將濾液濃縮至原來體積的1/4,然后用乙酸乙酯萃取，將水相用正 丁醇進行再次萃取，將正丁醇萃取液減壓濃縮獲得粗提物； (5)硅膠柱層析粗分:將步驟(4)制備的粗提物用甲醇溶解然后硅膠拌樣后裝柱，固定 相為80-100目的硅膠，以二氯甲烷：甲醇體積比=50:1~1:1梯度洗脫，硅膠薄層層析檢測， 合并二氯甲烷-甲醇的體積比為10:1的流份； (6)將上述步驟(5)中得到的流份經Sephadex LH-20凝膠柱層析洗脫，以二氯甲烷：甲 醇=1:1作為流動相，并經硅膠薄層層析檢測合并相同流份，獲得3個流份； (7)將步驟(5)得到的第三個流份反相高效液相色譜純化，以乙腈-水流動相，洗脫液 減壓濃縮除去乙腈和水，干燥，得環(甘-酪)二肽。
[0006] 所述平板培養基的配方為：蛋白胨l〇.〇g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄 糖20.0 g/L、乙酸鈉5. Og/L、檸檬酸二胺2. Og/L、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.58g/L、硫酸錳 0.25g/L、瓊脂15.0g/L，吐溫-80 l.OmL /L，pH 6.0。
[0007] 所述MRS液體培養基的配方為:蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡 萄糖20.0g/L、乙酸鈉 5.0g/L、檸檬酸二胺2.0g/L、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.58g/L、硫酸 錳0.25g/L、吐溫-80 l.OmL /L，pH 6.0。
[0008] 所述步驟(4)中發酵液旋蒸濃縮后離心分離的工藝條件為：離心條件為溫度4 °C， 轉速為5000rpm，離心時間20min。
[0009] 所述步驟(4)上清液用乙醇沉淀的具體操作為：向上清液中加入等體積的95%的乙 醇。
[0010] 所述步驟(4)中濃縮后濾液用乙酸乙酯萃取的具體操作是：將濃縮后濾液與乙酸 乙酯按體積比1:1混合，倒入分液漏斗中，搖瓶萃取2~3次，每次靜置20~30min，得到水相； 乙酸乙酯萃取得到的水相用正丁醇萃取的具體操作是:水相與正丁醇按體積比1:1混合，倒 入分液漏斗中，搖瓶萃取2~3次，每次靜置20~30min，得到正丁醇萃取液。
[0011]優選的，所述步驟(7)中的反相高效液相色譜條件為： 色譜柱：安捷倫pursuit C18，ΙΟμπι，150 X 21 · 2mm(I .D); 流動相組成為乙腈:水=5:95-50:50; 流速：15ml/min; 柱溫：25°C; 檢測波長:230,254nm; 進樣量:300-500μ1。
[0012]本發明產生的有益效果是:本發明以凝結芽孢桿菌為原料進行環(甘-酪)二肽的 提取，凝結芽孢桿菌是一種益生菌，其代謝產物具有天然性安全性，且提取方法簡單，成本 低，具有可持續性，制得的環(甘-酪)二肽純度高(可達99%)，對促進環(甘-酪)二肽藥理學 進一步研究和做為藥物先導化合物開發和利用具有重要意義。
【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1制備的環(甘-酪)二肽的4 NMR圖； 圖2為實施例1制備的環(甘-酪)二肽的13C NMR圖。
【具體實施方式】
[0014]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明的保護范圍不限于此。以 下實施例中的所用的凝結芽孢桿菌來源于中國典型培養物保藏中心(保藏編號:CCTCC NO: M2013193)。
[0015] 實施例1 一種從凝結芽孢桿菌中提取環(甘-酪)二肽的方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化:將凝結芽孢桿菌接種到平板培養基上，37 °C條件下培養24小時，獲得活 化菌種； (2) 初級培養:將步驟（1)中得到的活化菌種接種到MRS液體培養基中，在150r/min，37 °C條件下，搖床培養12小時，得種子液； (3) 次級培養:將步驟(2)得到的種子液接種到MRS液體培養基中，種子液的體積為MRS 液體培養基體積的4%，在150r/min，37 °C條件下，搖床培養48小時得發酵液； (4) 粗提物制備:將步驟(3)制備的發酵液旋蒸濃縮至原來體積的1/4后離心，取上清液 用乙醇沉淀，過濾并繼續將濾液濃縮至原來體積的1/4,然后用乙酸乙酯萃取，將水相用正 丁醇進行再次萃取，將正丁醇萃取液減壓濃縮獲得粗提物； (5)硅膠柱層析粗分:將步驟(4)制備的粗提物用甲醇溶解然后硅膠拌樣后裝柱，固定 相為80-100目的硅膠，以二氯甲烷：甲醇體積比=50:1~1:1梯度洗脫(二氯甲烷：甲醇體積 比為50:1，40 :1，30:1，20:1，10:1，1:1)，硅膠薄層層析檢測，收集二氯甲烷-甲醇的體積比 為10:1的流份； (6)將上述步驟(5)中得到的流份經Sephadex LH-20凝膠柱層析洗脫，以二氯甲烷：甲 醇=1:1作為流動相，并經硅膠薄層層析檢測合并相同流份，獲得3個流份； (7)將步驟