9631g； (4) 萃取:粗提物1.9631 g中分別加入50mL乙酸乙酯和50mL水，溶解粗提物，lOOOOrpm離 心3min，乙酸乙酯相和水相分層，用移液器吸取水相，將水相冷凍干燥得凍干粉，稱重 563.5mg； (5) Sephadex LH-20凝膠層析：用3mL甲醇溶解凍干粉563.5mg，離心取上清液，50°C旋 轉蒸發濃縮至2mL，用0.45μηι濾膜過濾后，上樣，通過Sephadex LH-20凝膠層析分離，凝膠層 析柱規格為2 X 50cm，Sephadex LH-20凝膠量為20g，洗脫劑為甲醇，流速0.6mL/min，收集 140~180min的餾分； (6) 半制備色譜分離:將上述餾分于50°C旋轉蒸發濃縮至2mL，再采用半制備色譜分離 純化，制備柱為C18柱(Hedera 0DS-2,5ym，10.0X250 mm)，檢測波長215nm，進樣量2mL，收 集保留時間為39.159 min和42.919 min的組分，于50°C旋轉蒸發除去乙腈后，冷凍干燥，分 別得G1和G2凍干粉31.4mg和28.6mg。
[0023] 上述半制備色譜梯度洗脫程序見表1，收集保留時間為39.159 min和42.919 min 的組分，分別命名為G1、G2。
[0024] 表1半制備色譜梯度洗脫程序
注:A，乙腈;B，水 結構鑒定:對G1、G2分別進行紅外光譜分析，發現二者紅外光譜相似，基本可以重合，且 與蛋白質類的紅外光譜圖相似，見圖1、圖2。
[0025] 茚三酮實驗:通過茚三酮實驗，G1和G2與茚三酮反應不顯色，在110°C經6mol/L鹽 酸水解2h后，與茚三酮反應顯橘紅色，見圖3,說明G1和G2為脂肽類化合物。
[0026]質譜分析:通過質譜分析，獲得G1、G2的[M+Na]+的m/z分別為1065.5、1079.5，得 到G1的相對分子質量為1042.5，G2的相對分子質量為1056.5，見圖4、圖5。
[0027]氨基酸分析:經氨基酸分析儀分析，得到G1和G2的氨基酸組成，見圖6、表2、圖7、表 3〇
[0028]表2 G1氨基酸組成分析結果
表3 G2氨基酸組成分析結果
二級質譜分析:經二級質譜分析，得到氨基酸的連接順序，見圖8,與已知化合物進行比 較，結果表明G1 為 C14 Mycosubtilin，G2為C15 Mycosubtilin。
[0029] 根據離子峰之間的差值推測氨基酸的連接順序，
，G1中存在肽的片段chain 1: Gin-Pro-Ser-Asn ,??
> ，G1 中存在肽的片段chain -Asn-lyr-Asn。綠tichain iWchain 個氧巷酸斤 段，G1中氨基酸的連接順序應為Asn-Tyr一Asn一Gin一Pro一Ser一Asn，分子中包含3個 Asn，1個Gin，1個Ser，1個Tyr，1個Pro，共7個氨基酸，和氨基酸分析儀分析的結果相符合。
[0030] HPLC分析檢測：色譜柱為C18柱，粒徑5 μL?，規格4.6X250 mm，采用二極管roA 進行檢測，檢測波長:220 nm，梯度洗脫程序見表4，C14 Mycosubti 1 in保留時間為7.4min， C15 Mycosubtilin保留時間為8.2min，見圖9、圖10,純度在98%以上。
[0031] 表4. HPLC檢測流動相洗脫程序
注:A，乙腈;B，水。
【主權項】
1. 對澄色粘球菌JCH-04的次級代謝產物進行分離純化提取抗霉枯草菌素的方法，該澄 色粘球菌JCH-04(Myxococcus化Ivus JCH-04)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中屯、保藏，保藏編號為:CGMCCNo . 2893;其特征是：取一環菌種接種于裝有25mL種子培 養基的250mL搖瓶中，30°C 18化pm培養2天得種子液;將種子液W體積比1:10接種于含有 IOOmL發酵培養基的500血S角瓶中，30°C 18化pm培養6天，得發酵液;將1000血發酵液用60 目篩過濾，收集樹脂，裝入層析柱中，用質量濃度20%甲醇沖洗，再用純甲醇洗脫，收集洗脫 液，50°C旋轉蒸發，濃縮得粗提物1.9631 g;粗提物中分別加入50mL的水和乙酸乙醋，混勻后 離屯、，吸取水相，冷凍干燥得凍干粉563.5mg;凍干粉用3mL純甲醇溶解，離屯、，取上清液通過 S邱hadex LH-20凝膠層析分離，流速0.6mL/min，收集140~ISOmin的饋分;將饋分于50 °C旋 蒸濃縮至2mL，通過半制備色譜分離，收集保留時間為39.159 min和42.919 min的組分，分 別為C14 Mycosubtilin和C15 Mycosubtilin。2. 根據權利要求1所述的對澄色粘球菌JCH-04的次級代謝產物進行分離純化提取抗霉 枯草菌素的方法，其特征是該方法具體步驟是： (1) 種子液培養:取上一環保藏編號為CGMCC No. 2893的澄色粘球菌JCH-04的菌種接種 于裝有種子培養基的搖瓶中，30°C 18化pm培養2天，得種子液;其中，1000 mL種子培養基配 方為：IOgi豆淀粉Jg葡萄糖Jg安琪酵母，知脫脂奶粉，Ig氯化巧，Ig硫酸儀，Smg乙二胺四 乙酸鐵鋼鹽，用去離子水定容至1000 mL, pH為7.2; (2) 發酵培養:將上述種子液W體積比1:10接種于含有IOOmL發酵培養基的SOOmLS角 瓶中，30°C 18化pm培養6天，得發酵液;其中1000 mL發酵培養基配方為：IOgi豆淀粉，地葡 萄糖，地安琪酵母，知脫脂奶粉，Ig氯化巧，1 g硫酸儀，Smg乙二胺四乙酸鐵鋼鹽，5g甘油，20g XAD-16大孔吸附樹脂，用去離子水定容至1000 mUpH為7.2; (3) 提取粗產物:將上述1000 mL發酵液用60目篩過濾，收集樹脂，先用水洗去樹脂表面 殘留的發酵液，然后將樹脂裝入玻璃層析柱中，層析柱規格2 X 50cm，用IOOmL質量濃度20% 甲醇WlmL/min的流速流過樹脂柱清洗樹脂，再用純甲醇WlmL/min的流速洗脫樹脂，收集 甲醇洗脫液200mL，將200mL甲醇洗脫液于50°C旋轉蒸發，濃縮得油脂狀粗提物，稱重 1.9631g; (4) 萃取:粗提物1.963Ig中分別加入50mL乙酸乙醋和50mL水，溶解粗提物，1000 Orpm離 屯、3min，乙酸乙醋相和水相分層，用移液器吸取水相，將水相冷凍干燥得凍干粉，稱重 563.Smg； 巧）Sephadex LH-20凝膠層析：用3mL純甲醇溶解凍干粉563.5mg，離屯、取上清液，通過 S邱hadexLH-20凝膠層析分離，凝膠層析柱規格為2X50cm，SephadexLH-20凝膠量為20g， 洗脫劑為純甲醇，流速0.6mL/min，收集140~ISOmin的饋分； (6)半制備色譜分離：將上述饋分于50°C旋轉蒸發濃縮至2mL，再采用半制備色譜分離 純化，制備柱為C18柱(Hedera0DS-2,5皿，10.0X250 mm)，檢測波長215nm，進樣量2血，收 集保留時間為39.159 min和42.919 min的組分，于50°C旋轉蒸發除去乙臘后，冷凍干燥，分 別得C14 Mycosubtilin 31.4mg和C15 Mycosubtilin 28.6mg。3. 根據權利要求2所述的對澄色粘球菌JCH-04的次級代謝產物進行分離純化提取抗霉 枯草菌素的方法，其特征是：C14 Mycosubtilin的分子式為C48H74O14N12，C15 MycosubtiIin的分子式為 C4姐76〇i4Ni2;C14 MycosubtiIin分子結構式為：C15 Mycosubtilin為其同系物，在脂肪酸直碳鏈上多一個亞甲基(-CH2)。
【專利摘要】本發明公開了對橙色粘球菌JCH-04次級代謝產物分離純化提取抗霉枯草菌素的方法，該橙色粘球菌JCH-04（Myxococcus？fulvus？JCH-04）在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏；取菌種接種于種子培養基的搖瓶中培養得種子液；將種子液接種于發酵培養基的三角瓶中培養得發酵液；將發酵液過濾，收集樹脂裝入層析柱中，洗脫液濃縮得粗提物；粗提物中加入水和乙酸乙酯，混勻后離心，吸取水相，干燥得凍干粉；凍干粉甲醇溶解，離心，取上清液濃縮，通過Sephadex？LH-20凝膠層析分離，收集140~180min餾分；餾分濃縮，通過半制備色譜分離，收集保留時間39.159？min和42.919？min的組分，分別為C14？Mycosubtilin和C15？Mycosubtilin。本發明方法簡單，由橙色粘球菌次級代謝產物分離純化提取抗霉枯草菌素，擴大了抗菌脂肽的提取途徑。CGMCC No.289320090122
【IPC分類】C07K7/64, C07K1/14, C12R1/01, C07K1/16, C12P21/04
【公開號】CN105648001
【申請號】
【發明人】賈建波, 劉軒豪, 李 東
【申請人】淮陰工學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月28日