(5)得到的第三個流份以乙腈-水為洗脫劑反相高效液相色譜純化，反相高 效液相色譜條件為： 色譜柱：安捷倫pursuit C18，ΙΟμπι，150 X 21 · 2mm(I .D); 流動相組成為乙腈:水=5:95-50:50(在lOmin內乙腈和水的體積比逐步從5:95過渡 至Ij50:50); 流速：15ml/min; 柱溫：25°C; 檢測波長:230,254nm; 進樣量:300μ1; 洗脫時間為15min; 洗脫液減壓濃縮除去乙腈和水，干燥，得環(甘-酪)二肽(純度99.1%)。
[0016] 所述平板培養基的配方為：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄 糖20.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、檸檬酸二胺2.0g/L、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.58g/L、硫酸錳 0.25g/L、瓊脂15.0g/L，吐溫-80 l.OmL /L，pH 6.0。
[0017]所述MRS液體培養基的配方為:蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡 萄糖20.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、檸檬酸二胺2.0g/L、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.58g/L、硫酸 錳0.25g/L、吐溫-80 l.OmL /L，pH 6.0。
[0018]所述步驟(4)中發酵液旋蒸濃縮后離心分離的工藝條件為：離心條件為溫度4 °C， 轉速為5000rpm，離心時間20min。
[0019]所述步驟(4)上清液用乙醇沉淀的具體操作為：向上清液中加入等體積的95%的乙 醇。
[0020] 所述步驟(4)中濃縮后濾液用乙酸乙酯萃取的具體操作是：將濃縮后濾液與乙酸 乙酯按體積比1:1混合，倒入分液漏斗中，搖瓶萃取2次，每次靜置30min，得到水相；乙酸乙 酯萃取得到水相用正丁醇萃取的具體操作是:水相與正丁醇按體積比1:1混合，倒入分液漏 斗中，搖瓶萃取2次，每次靜置30min，得到正丁醇萃取液。
[0021] 由圖1 一2可知，經1H NMR、13C NMR分析，比對文獻(郭瓊，王劍，姚俊華，等.一 株南海珊瑚細菌L-4抗腫瘤活性次生代謝產物研究[J].中山大學學報，2013, 52(3): 77-82 .)，確認提取到的化合物為環(甘-酪)二肽。
[0022] 上述實施例為本發明優選的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明所作的改變均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保 護范圍之內。
【主權項】
1. 一種從凝結芽抱桿菌中提取環(甘-酪)二膚的方法，環(甘-酪)二膚的結構式如下：其特征在于，所述方法包括W下步驟： (1) 菌種活化:將凝結芽抱桿菌接種到平板培養基上，37°C條件下培養24小時，獲得活 化菌種； (2) 初級培養:將步驟（1)中得到的活化菌種接種到MRS液體培養基中，在15化/min，37 °C條件下，搖床培養12~16小時，得種子液； (3) 次級培養:將步驟(2)得到的種子液接種到MRS液體培養基中，種子液的體積為MRS 液體培養基體積的4~6%，在15化/min，37 °C條件下，搖床培養48~72小時得發酵液； (4) 粗提物制備:將步驟(3)制備的發酵液旋蒸濃縮至原來體積的1/4后離屯、，取上清液 用乙醇沉淀，過濾并繼續將濾液濃縮至原來體積的1/4,然后用乙酸乙醋萃取，將水相用正 下醇進行再次萃取，將正下醇萃取液減壓濃縮獲得粗提物； 巧)硅膠柱層析粗分:將步驟(4)制備的粗提物用甲醇溶解然后硅膠拌樣后裝柱，固定 相為80-100目的硅膠，W二氯甲燒：甲醇體積比=50:1~1:1梯度洗脫，硅膠薄層層析檢測， 收集二氯甲燒-甲醇的體積比為10:1的流份； (6)將上述步驟(5)中得到的流份經S邱hadex LH-20凝膠柱層析洗脫，W二氯甲燒：甲 醇=1:1作為流動相，并經硅膠薄層層析檢測合并相同流份，獲得3個流份； (7)將步驟(5)得到的第=個流份采用反相高效液相色譜純化，減壓濃縮，干燥，得環 (甘-酪)二膚。2. 如權利要求1所述的從凝結芽抱桿菌中提取環(甘-酪)二膚的方法，其特征在于，所 述平板培養基的配方為:蛋白腺lO.Og/L、牛肉膏lO.Og/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、 乙酸鋼5. Og/L、巧樣酸二胺2. Og/L、憐酸氨二鐘0.4g/L、硫酸儀0.58g/L、硫酸儘0.25g/L、瓊 脂 15.0g/L，吐溫-80 l.OmL /L，pH 6.0。3. 如權利要求1所述的從凝結芽抱桿菌中提取環(甘-酪)二膚的方法，其特征在于，所 述MRS液體培養基的配方為:蛋白腺10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏5. Og/L、葡萄糖20.0 g/ L、乙酸鋼5. Og/L、巧樣酸二胺2. Og/L、憐酸氨二鐘0.4g/L、硫酸儀0.58g/L、硫酸儘0.25g/L、 吐溫-80 1.OmL /L，pH 6.0。4. 如權利要求1所述的從凝結芽抱桿菌中提取環(甘-酪)二膚的方法，其特征在于，所 述步驟（4)中發酵液旋蒸濃縮后離屯、分離的工藝條件為：離屯、條件為溫度4°C，轉速為 5000巧m，離屯、時間20min。5. 如權利要求1所述的從凝結芽抱桿菌中提取環(甘-酪)二膚的方法，其特征在于，所 述步驟(4)上清液用乙醇沉淀的具體操作為：向上清液中加入等體積的95%的乙醇。6. 如權利要求1所述的從凝結芽抱桿菌中提取環(甘-酪)二膚的方法，其特征在于，所 述步驟(4)中濃縮后濾液用乙酸乙醋萃取的具體操作是：將濃縮后濾液與乙酸乙醋按體積 比1:1混合，倒入分液漏斗中，搖瓶萃取2~3次，每次靜置20~30min，得到水相；乙酸乙醋萃 取得到水相用正下醇萃取的具體操作是：水相與正下醇按體積比1:1混合，倒入分液漏斗 中，搖瓶萃取2~3次，每次靜置20~30min，得到正下醇萃取液。7.如權利要求1所述的從芽抱乳酸桿菌中提取環(甘-酪)二膚的方法，其特征在于，所 述步驟(7)中的反相高效液相色譜條件為： 色譜柱:安捷倫pursuit C18,10皿，150 X 21.2mm; 流動相組成為乙臘:水=5:95-50:50; 流速：15ml/min; 柱溫：25°C; 檢測波長:230,254nm; 進樣量:300-500山。
【專利摘要】本發明公開了一種從凝結芽孢桿菌（芽孢乳酸菌）中提取環(甘-酪)二肽的方法方法。制備環(甘-酪)二肽方法主要包括菌種活化及培養，粗提物的獲得，將粗提物經硅膠柱層析粗分，凝膠柱層析細分，并經HPLC進一步純化，TLC跟蹤檢測，得到化合物經核磁檢測并與文獻對比鑒定為環(甘-酪)二肽。本發明所用原料凝結芽孢桿菌是一種益生菌，安全無害，提取工藝簡單，成本低；制得的化合物純度高。
【IPC分類】C07D241/08, C12P21/04, C12R1/07
【公開號】CN105648002
【申請號】
【發明人】陳林, 郭慶豐, 馬經緯, 康文藝
【申請人】黃河科技學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月1日