(RP-HPLC)純化，得抗氧化膠原肽。
[0020]①離子交換樹脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為28mg/mL的溶液，經過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為1.0?1.2 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于225 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的羥自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物DCP-1II(圖1);
②凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為25mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為1.0 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于225 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的羥自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物DCP-1I 1-3(圖2);
③RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成40yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化(RP-HPLC條件為:進樣量18 yL;色譜柱Zorbax SB- Ci8(250 mmX4.6 mm,5 μπι)；流動相:40%乙腈;洗脫速度0.8 mL/min;紫外檢測波長225 nm)，根據對羥自由基的清除活性得I個高活性抗氧化膠原肽Gly-1Ie-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp (GIEGEEGW)(圖3)。
[0021]④結構檢測:收集DPPH自由基和羥自由基清除活性最高的抗氧化膠原肽，經RP-HPLC檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Gly-1le-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp (GIEGEEGW)，ESI_MS測定分子量為875.85 Da([M+H]+ 876.81 Da)(圖4)。
[0022]將制得的赤魟軟骨抗氧化膠原肽(}17-110-(；111-(；17-(；111-(；111-(；17-1^1)(GIEGEEGW)進行自由基清除實驗和脂質過氧化抑制實驗，實驗結果表明:Gly-1le-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp (GIEGEEGW)對DPPH 自由基(EC50 1.93 mg/mL)、羥自由基(EC50
0.35 mg/mL)、ABTS自由基(EC50 0.16 mg/mL)和超氧陰離子自由基(ECso 0.24 mg/mL)具有良好清除作用；同時，Gly-1le-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp (GIEGEEGW)亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用(圖5)。
[0023]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)赤魟軟骨膠原蛋白的制備:將赤魟軟骨曬干、粉碎，按照料液比Ig: 15?20 mL加入到NaOH溶液于I?4°C下浸泡2?4 h，脫除非膠原蛋白；處理后赤魟軟骨用蒸餾水反復洗滌至中性、瀝干，按照料液比I g: 5?8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液，于I?4°C下浸泡2?3天，蒸餾水洗滌2?3次，干燥、粉碎，得脫鈣赤魟軟骨粉;將脫鈣赤魟軟骨粉按照料液比I g: 5?8 11^加入到0.5 mol/L乙酸溶液并在I?4°C下動態浸泡3 d，10 OOOg離心20?25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液終濃度為1.0 mol/L，靜置60?90 min, 12 OOOg離心25?30 min得沉淀物，冷凍干燥即為赤魟軟骨膠原蛋白； 2)赤魟軟骨膠原蛋白的酶解:將赤魟軟骨膠原蛋白按照料液比Ig: 15?20 mL加入到磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，按照膠原蛋白質量的1.0?1.5%向溶液中加入胰蛋白酶，于溫度45?50 °C酶解3?4 h后，將溶液升溫至90?95 °C，并于此溫度保持8?10 min后，冷卻至45?500C ；按照膠原蛋白質量的1.5?1.8%向溶液中加入中性蛋白酶，于溫度45?50°C下酶解6?8 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持15?20 min后，10 OOOg離心20?25 min，取上清液，即為酶解產物； 3)赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備:將上述酶解產物采用3.5kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3.5 kDa部分，凍干，得超濾酶解物;將超濾酶解物次經離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化，得抗氧化膠原肽； 其中，所述步驟I)中的NaOH溶液為0.1 mol/L；EDTA溶液為0.5 mol/L,且每天更換I次；步驟2)中的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為0.2 mol/L、pH值為7.5;胰蛋白酶為1.9 X14 U/g ;中性蛋白酶為1.0XlO5 U/g ο2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)的赤魟為赤魟即Dasyatisakajei ο3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)的離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為: 離子交換樹脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為25?30 mg/mL的溶液，經過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為0.9?1.2 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于225 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的羥自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物； 凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為25?30 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G_25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.8?1.0 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于225 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的輕自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物； 反相高效液相色譜純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成40?50 yg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進行純化，根據對羥自由基的清除活性得I個高活性抗氧化膠原肽Gly-1le-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp，ESI_MS測定分子量為875.85 Da。4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述反相高效液相色譜的條件為:進樣量15?20 yL;色譜柱是規格為250 mmX4.6 mm,5 μπι的Zorbax SB- Cis;流動相為40%乙腈；洗脫速度0.8?1.0 mL/min;紫外檢測波長225 nm。5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所制備的抗氧化膠原肽Gly-1le-Glu- Gly-Glu-Glu-Gly-Trp為八肽化合物，ES1-MS測定分子量為875.85 Da。
【專利摘要】本發明公開了一種赤魟軟骨抗氧化膠原肽的制備方法。本發明以赤魟軟骨為原料，通過膠原蛋白提取、胰蛋白酶和中性蛋白酶雙酶酶解得酶解液，酶解液采用超濾、離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到抗氧化膠原肽Gly-Ile-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp，ESI-MS測定分子量為875.85Da；制備的高活性抗氧化膠原肽對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用，可以作為藥品、保健食品或食品添加劑進行開發。
【IPC分類】C07K1/36, C07K14/78, C07K1/34, C12P21/06, C07K1/20, C07K1/18, C07K1/16
【公開號】CN105648004
【申請號】
【發明人】徐銀峰, 王斌, 孫坤來, 楊帆
【申請人】浙江海洋學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月31日