人參稀有皂苷c-k、f1及四種異構體人參皂苷元的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種人參稀有皂苷和四種異構體人參皂苷元的制備方法，尤其是一種 操作簡單、成本低、得率及純度高、適合大批量生產的人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人 參皂苷元的制備方法。
【背景技術】
[0002] 我國目前產量高的人參主要為人參（Panax ginseng C.A.Mayer)、西洋參（P. quinguefolus L.)和三七參（P. notoginseng burk)。人參根的主要阜苷為Rbl、Rb2、Rb3、 此、1?(1、1^、1^1;西洋參的主要皂苷以肋1和1^為主，還含肋2、1^、1?(1、1^1皂苷 ;三七參的主要 皂苷以Rbl和Rgl為主，還含Rd、Re、Rl皂苷;其他皂苷含量較低。
[0003] 人參主要原人參二醇類(pro)皂苷結構如下：
注:Glc, β-D-吡喃葡萄糖基;Arap, α-L-吡喃阿拉伯糖基;Araf, α-L-咲喃阿拉伯糖 基;Xyl，i3-D_吡喃木糖基。
[0004] 紅參中存在四種異構體的人參二醇皂苷元和人參三醇皂苷元（文獻：Lars P. Christensen ed. Ginsenosides: Chemistry, Biosynthesis , Analysis , and Potential Health Effects. Advances in Food and Nutrition Research. (2009) Volume 55, p.1-99. Elsevier Inc·)。
[0005] 紅參中存在的四種異構體的人參二醇皂苷元為20(s)-人參二醇皂苷元[20(S)_ prool]，20(R)_人參二醇皂苷元[20(R)-PPD01]，20-羥基脫的20(21) ,24-二烯人參二醇皂 苷元[PPD01(-H20)-20(21)，24-diene]，20_羥基脫水的20(22) ,24-二烯人參二醇皂苷元 [PPD01(-H20)-20(22),24-diene]； 人參稀有皂苷C-K和四種異構體的人參二醇皂苷元結構如下：
汪：Glc，P-U-TO_匍甸椐盎；肋a，a-L-TO_風字椐盎；Xy 1，P-U-TO_不椐盎。
[0006] 紅參中存在的四種異構體的人參三醇皂苷元為20(S)_人參三醇皂苷元[20(S)_ PPTol ]，20(R)_人參三醇皂苷元[20(R)-PPT01 ]，20-羥基脫水人參三醇皂苷元-20(21)， 24-二烯[PPTol(-H20)-20(21)，24-diene]，20-羥基脫水人參三醇皂苷元-20(22)，24-二 烯[PPTol (-H20)-20(22)，24-diene]。上述人參皂苷元異構體，紅參中極其微量存在。
[0007] 人參稀有皂苷F1和四種異構體的人參三醇皂苷元結構如下：
四種異構體的人參二醇皂苷元和四種異構體的人參三醇皂苷元的生理活性遠高于人 參皂苷。
[0008] 人參口服后在腸道菌的作用下人參二醇類皂苷(Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd#W^SC-K， 人參三醇類皂苷(Re、Rgl)轉化為F1，繼而被吸收、起藥效；因此，人參皂苷C-K和F1是吸收率 高、生理活性高的人參稀有阜苷（文獻:]\ /11(3的〇1^，1'01^〇，1(1((^3811；[.]"1'^(1]\^(1· 1994 11， 241-245)。
[0009] 因此，大量制備高活性人參稀有皂苷c-κ和F1、四種異構體的人參二醇皂苷元和人 參三醇皂苷元，對人參制品、保鍵食品和化妝品以及藥物開發意義很大。
[0010]為了得到高活性、容易吸收的的人參稀有皂苷，國際專利申請PCT/CN00/00744(中 國ZL0082112.9、歐洲EP1354944、美國發明專利US7,759，101B2、日本JP-4953547;文獻2) 等，公開了從人參中含量高的仙1、仙2、1^、1?(1、1^和1^1酶轉化制備1^2、1^3、(：-1(、1^2和1^1 等;所公開的人參皂苷酶來自細菌、霉菌、酵母菌、麥芽、人參植物、動物肝，按照水解皂苷糖 基位置不同，分為四種人參皂苷酶:人參皂苷酶I型，能水解人參二醇皂苷Rbl、Rb2、Rb3、Rc 等的3-0-(第三碳)糖基和20-0-糖基，逐步得到Rd-F2-C-K(或Rh2)等皂苷;人參皂苷酶II 型，能水解人參二醇皂苷Rbl、Rb2、Rb3、Rc等20-0-糖基，逐步生成Rd和Rg3;人參皂苷酶III 型，能水解人參皂苷Rd的3-0-糖基，生成C-Κ;人參皂苷酶IV型，能水解人參皂苷Re和Rg2的 6-0-糖基，生成Rgl和Rhl。
[0011] 如上所述可利用人參皂苷酶III型轉化Rd單體皂苷制備C-K，但是Rd單體和人參皂 苷酶III純酶成本太高，產業化難度大;其他二醇皂苷酶反應，雖然產生c-κ皂苷，但反應物 有很多其他皂苷副產物，不僅c-κ轉化率低，而且還增加了產物中分離c-κ的步驟，操作麻 煩。
[0012] 論文（J. Microbiol. Biotechnol. 2011，21(10)，1057-1063)報道，來自米曲 霉的人參皂苷酶IV水解Re和R1皂苷的6-0-鼠李糖和木糖基變成Rgl，進一步水解Rgl的6-0-葡萄糖基變成F1皂苷，Rg2轉化為Rhl和20 (S)-人參三醇苷元。
[0013] 論文（J. Microbiol. Biotechnol. 2012; 22，343~351;論文PLOS 0NE，2014， (9)，1-16，e96914 (Pos One: June 2014/ Volume 9/ Issue 6 /e96914,文獻5)報道， 很多新發現的微生物的酶、轉基因克隆得到的人參皂苷酶，能水解人參皂苷Rbl、Rb2、Rc、 RcURe 和 Rgl 的生成相應的低糖基稀有皂苷 F2、C-K、Fl、20(S)-Rg2、20(S)-Rg3、20(S)-Rhl、 20(S)-Rh2;但是這些酶反應產生很多副產物。
[0014] 日本小橋等（文獻：M Kanaoke，T Okao，K Kobashi · J Trad Med · 1994 11， 241-245)報道，人參口服后在腸道菌的作用下人參二醇類皂苷Rbl等逐漸轉化為Rd，F2，C-K、20(S)_二醇皂苷元;人參三醇類皂苷Re等逐漸轉化為Rgl、Fl、20(S)_三醇皂苷元被吸收， 但其轉化微弱。
[0015] 因此，現有技術所公開的酶轉化法水解人參二醇類皂苷Rbl、Rb2、Rb3、RC、Rc^iJg C-κ皂苷或酶轉化法水解人參三醇類皂苷Re、Rl、Rgl制備F1皂苷，均存在著副產物多，稀有 皂苷C-Κ或F1轉化率低等缺點，且需要從眾多副產物中分離提純，操作麻煩、難度大;而且上 述酶反應只能微量地生成20 (S)-人參二醇皂苷元和20 (S)-人參三醇皂苷元，無法生產四種 異構體的皂苷元。
【發明內容】
[0016] 本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡單、成本低、 得率及純度高、適合大批量生產的人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方 法。
[0017] 本發明的技術解決方案是:一種人參稀有皂苷C_K、F1及四種異構體人參皂苷元的 制備方法，其特征在于按照如下步驟進行： a.以人參為原料，提取人參二醇類皂苷混合物和人參三醇類皂苷混合物； 具體可如下： 將人參、西洋參或三七參切碎，用8~10倍(重量/體積）甲醇或者70~80%乙醇在常溫或 者30~50°C提取6~24小時，重復提取3次，合并提取液，減壓濃縮至波美度20~24(回收有 機溶劑），得到濃縮液;將濃縮液用30~50%體積的石油醚脫脂2~3次，脫脂后人參提取液加 3~5倍體積的水稀釋，大孔樹脂柱(柱體積為人參重量的2倍體積）中反復吸附皂苷，用5~8 倍體積的去離子水洗脫除糖等雜質；然后用乙醇-水梯度洗脫樹脂柱：乙醇濃度梯度為30% ~84%，洗脫劑總體積為柱體積的7~10倍。用TLC方法檢測皂苷，分別收集原人參三醇類皂 苷洗脫液部分和原人參二醇類皂苷洗脫液部分;再分別減壓濃縮（回收乙醇）、干燥，分別得 到原人參三醇類(PPT)皂苷和原人參二醇類(pro)皂苷。
[0018] 從人參提取的原人參二醇類皂苷經HPLC方法檢測，主要含Rbl、Rb2、Rc、Rd，少量含 Rb3,原人參三醇類皂苷主要含Re和Rgl;從西洋參提取的原人參二醇類皂苷主要含Rbl、 仙2、此、1?(1，原人參三醇類皂苷主要含1^和1^1;從三七參提取的原人參二醇類皂苷主要含 Rbl、Rd，原人參三醇類皂苷主要含Rgl、Re、Rl。
[0019] b.分別以人參二醇類皂苷混合物或人參三醇類皂苷混合物為原料，與有機溶劑 及緩沖液配制成底物溶液，再將底物溶液與曲霉菌微生物發酵得到的粗酶液反應； c.分別提取反應液中皂苷，得到人參稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1。
[0020] 所述底物溶液中緩沖液的pH為4.5~6.0，濃度為0.01~0.05M，有機溶劑的質量濃 度為5~40%，人參二醇類皂苷混合物或人參三醇類皂苷混合物的質量濃度為0.5~8%;所述 緩沖液為醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖液，所述有機溶劑為丙醇、丙酮、乙醇或甲 醇。
[0021] 所述粗酶液是采用黑曲霉菌或者米曲霉菌液態發酵或者固態發酵，酶發酵培養基 的產酶誘導物是人參粉、人參總皂苷或槐花粉;對發