products. 1984，Volume 46，1-76, the IV. Modern Techniques Used in Structure Determination, p22~36. ( 2. 13C_ NMR Spectroscopy of Dammarane Type Triterpenes， p23_26; 3. Glycosylation Shifts in 13C_NMR Spectra， p26_35) 2) 李亞平(主編）.人參皂苷NMR標準圖譜.化學工業出版社，北京，2012。
[0062]經比較，與參考文獻一致。證明所制備的產物為人參皂苷C-K和人參二醇皂苷元四 種異構體： 2〇(s)-人參二醇皂苷元[20(s)-pro0i]， 20(R)_人參二醇皂苷元[20(R)-Pro0l]， 20-羥基脫水的20(21) ,24-二烯人參二醇皂苷元[ΡΗ)ο1(-Η20-20(21 )，24-diene]， 20(22) ,24-二烯人參二醇皂苷元[PPDol(-H20-20(22)，24-diene]; 其結構與【背景技術】所述一致。
[0063]同時證明所制備產物為人參皂苷F1和人參三醇皂苷元四種異構體為： 20(S)_人參三醇皂苷元[20(S)-PPT01]; 20(R)_人參三醇皂苷元[20(R)-PPT01]; 20-羥基脫水的20(21) ,24-二烯人參三醇皂苷元[PPTol(-H20-20(21 )，24-diene]， 20-羥基脫水的20(22) ,24-二烯人參三醇皂苷元[PPTol(-H20-20(22)，24-diene]; 其結構與【背景技術】所述一致。
[0064]本發明實施例中采用的人參皂苷測定方法： 1)薄層層析(TLC)測定人參皂苷： 人參pro皂苷和PPT皂苷測定:層析板，硅膠板Silica Gel 60 F254(德國Merck產品）； 展開劑，正丁醇：乙酸乙酯:水=4:1:2。人參稀有皂苷在TLC板上展開后，吹干、噴10%硫酸、 110°C顯色； 酶反應生成C-K、F1的測定:層析板，硅膠板Silica Gel 60 F254(德國Merck產品）；展 開劑，氯仿：甲醇：水=7.5:2.5:0.5。人參稀有皂苷在TLC板上展開后，吹干、噴10%硫酸、 110°C顯色； C-K、F1轉化得到人參二醇苷元和人參三醇苷元的測定:層析板，硅膠板Silica Gel 60 F254(德國Merck產品）；展開劑，氯仿：甲醇:水=7.5:2.5:0.5。人參稀有皂苷在TLC板上展 開后，吹干、噴10%硫酸、ll〇°C顯色。
[0065] 2)高效液相色譜(HPLC)法測定人參皂苷： 人參皂苷、c-κ和F1的測定:色譜儀，美國Waters2695高效液相色譜分析儀，Waters2996 光電二極管陣列（PDA)檢測器及Empower色譜工作站；色譜柱:Knauer C18柱（5μηι，Φ3ι?πιΧ 250mm);流動相：乙腈(A)-水(Β) : 0-20min，20%Α等度；20-31min，20%Α-32%Α線性梯度，31-40min，32%Α-43%Α線性梯度；40-70min，43%Α-100%Α線性梯度；進樣量：10yL;柱溫：35°C ;體 積比流速:〇.6mL/min;檢測波長：203nm〇
[0066] 四種異構體人參二醇皂苷元和人參三醇皂苷元的測定：色譜條件：色譜儀， Waters2695高效液相色譜分析儀，Waters2996光電二極管陣列（PDA)檢測器及Empower色譜 工作站；色譜柱：Unitary C18柱（5μηι，Φ 4.6mmX 250mm);流動相：乙腈(A)-水（B) :0_5min， 20%A-40%A等度；5-10min，40%A-60%A線性梯度，10 -70min，60%A-100%A線性梯度;進樣量： 10yL;柱溫：35°C ;體積比流速:0.6mL/min;檢測波長:203nm。
[0067] 3)核磁共振法(NMR)測定酶反應得到的人參稀有皂苷C-Κ和F1、各皂苷元的結構： 儀器是瑞士Bruke AVANCE 600超導核磁共振波普儀;探頭，5mm ΒΒ0;溶劑，Pyridine- D 5 (氘代吡啶）。用核磁共振法測定：酶轉化得到的單體人參稀有皂苷的一維1 Η匪R、13 C NMR、DEPT圖譜;二維氫譜C0SY、二維碳氫相關譜HSQC和HMBC;-維1H NMR譜的觀測頻率為 600 MHz，13C NMR譜的觀測頻率為150 MHz條件下。將分別測定得到的、人參稀有皂苷C-Κ和 F1、各皂苷元的1HNMR、13CNMR、DEPT45、DEPT90、DEPT135、C0SY、HSQC、HMBC核磁共振圖 譜，與參考文獻1和2的數據比對，確認酶轉化得到的人參稀有皂苷C-Κ和F1、各皂苷元的結
【主權項】
1. 一種人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其特 征在于按照如下步驟進行： a. 以人參為原料，分離提取人參二醇類皂苷混合物、人參三醇類皂苷混合物； b. 分別以人參二醇類皂苷混合物或人參三醇類皂苷混合物為原料，與有機溶劑及緩 沖液配制成底物溶液，再將底物溶液與曲霉菌微生物發酵得到的粗酶液反應； c. 分別提取反應液中皂苷，得到人參稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1。2. 根據權利要求1所述人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其 特征在于所述底物溶液中緩沖液的pH為4.5~6.0，濃度為0.01~0.05M，有機溶劑的質量濃 度為5~40%，人參二醇類皂苷混合物或人參三醇類皂苷混合物的質量濃度為0.5~8%;所述 緩沖液為醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖液，所述有機溶劑為丙醇、丙酮、乙醇或甲 醇。3. 根據權利要求2所述人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其 特征在于所述粗酶液是采用黑曲霉菌或者米曲霉菌液態發酵或者固態發酵，酶發酵培養基 的產酶誘導物是人參粉、人參總皂苷或槐花粉;對發酵酶液或者固態發酵酶提取液離心除 渣，收集酶蛋白沉淀，將酶蛋白沉淀溶解于緩沖液中即可。4. 根據權利要求3所述人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其 特征在于所述底物溶液與粗酶液反應是將底物溶液與粗酶液混合，在35~60 °C反應16~48 小時;所述底物溶液與粗酶液的體積比為1: 〇. 1~1。5. 根據權利要求1、2、3或4所述人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備 方法，其特征在于所述c步驟提取反應液中皂苷如下:加入反應液2~4倍體積的有機溶劑沉 淀酶蛋白，得上清液，經脫色大孔樹脂柱脫色、減壓濃縮及回收有機溶劑得濃縮液，再將所 得濃縮液經大孔樹脂柱反復吸附皂苷，用5~8倍柱體積的去離子水洗脫雜質，再用4~6倍 柱體積的質量濃度為80~96%的有機溶劑洗脫皂苷，濃縮、結晶及干燥，得到人參稀有皂苷 C-K或人參稀有皂苷F1。6. 根據權利要求1的人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其特 征在于將所得到的人參稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1與從人參根中提取的人參自身皂苷 酶復合物反應，在60~85°C反應1.5~10小時，分別提取反應液中皂苷元，得到由20(S)-人 參二醇皂苷元、20(R)_人參二醇皂苷元、其20-羥基脫水的20(21) ,24-二烯人參二醇皂苷元 和20(22)，24_二烯人參二醇皂苷元的四種異構體組成的人參二醇皂苷元;或者得到20(S)_ 人參三醇皂苷元、20(R)_人參三醇皂苷元、其20-羥基脫水的20(21) ,24-二烯人參三醇皂苷 元和20(22) ,24-二烯人參三醇皂苷元的四種異構體組成的人參三醇皂苷元。7. 根據權利要求6所述的人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法， 其特征在于所述人參稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1與從人參根中提取的人參自身皂苷酶 復合物的質量比是1:0.1~10,所述反應體系中加有反應體積〇. 1~50%的甲酸、乙酸或梓檬 酸，人身稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1反應質量濃度0.1~10%。8. 根據權利要求7所述人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其 特征在于所述人參自身皂苷酶復合物按如下方法制備:在所述a步驟提取人參二醇類皂苷 混合物和人參三醇類皂苷混合物后的人參渣中，加入人參渣干重的5~6倍水，在55~75°C 攪拌2~3小時，離心收集上清，在65°C以下高真空濃縮至波美度20~25,即為人參自身皂苷 酶復合物。
【專利摘要】本發明公開一種人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參二醇皂苷元和參三醇皂苷元的制備方法。以人參為原料，提取人參二醇類皂苷（混合物）、人參三醇類皂苷（混合物）和人參自身皂苷酶復合物。人參二醇類皂苷和三醇類皂苷，分別與有機溶劑及緩沖液配制成底物溶液，分別與曲霉菌微生物發酵得到的粗酶液反應，幾乎沒有其他副產物皂苷，分別得到人參稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1；反應后酶可回收、重復使用。所得到的C-K或F1皂苷與人參自身皂苷酶復合物分別反應（適當加入有機酸），分別得到四種異構體人參二醇皂苷元和人參三醇皂苷元。操作簡單、收率高，成本低，適合大批量生產；所得產品可用于藥物開發、人參制品、保健品和化妝品。
【IPC分類】C12P33/00, C12P33/20
【公開號】CN105648021
【申請號】
【發明人】魚紅閃, 劉春瑩, 金鳳燮
【申請人】金鳳燮
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月5日