酵酶液或者固態發酵酶提取液離心除 渣，收集酶蛋白沉淀，將酶蛋白沉淀溶解于緩沖液中即可。
[0022] 具體可按如下方法:液態培養基的產酶誘導物加量為培養基質量的0.005~0.1%; 固態培養基的產酶誘導物加量為培養基質量的1~25%;發酵培養溫度27~35°C，培養發酵 時間3~9天。對發酵酶液或者固態發酵酶提取液離心除渣，上清用硫酸銨、甲醇或者乙醇沉 淀酶蛋白，收集沉淀，其酶蛋白沉淀溶解于0.005~0.1摩爾、pH為4.5~6.5的醋酸、檸檬酸 或者磷酸緩沖液;溶解酶蛋白沉淀的緩沖液用量:液態發酵發酵液的1/5~1/20體積；固態 發酵發酵時，〇. 5~2倍固體原料的重量體積，即為可用的粗酶液。
[0023] 所述底物溶液與粗酶液反應是將底物溶液與粗酶液混合，在35~60°C反應16~48 小時;所述底物溶液與粗酶液的體積比為1: 〇. 1~1。
[0024]所述C步驟提取反應液中皂苷如下：加入反應液2~4倍體積的有機溶劑沉淀酶蛋 白，得上清液，經脫色大孔樹脂柱脫色、減壓濃縮及回收有機溶劑得濃縮液，再將所得濃縮 液經大孔樹脂柱反復吸附皂苷，用5~8倍柱體積的去離子水洗脫雜質，再用4~6倍柱體積 的質量濃度為80~96%的有機溶劑洗脫皂苷，濃縮、結晶及干燥洗脫液，得到人參稀有皂苷 C-K或人參稀有皂苷F1。所沉淀的酶蛋白，溶解于70~80%原酶液體積的緩沖液中，得到回收 酶液，可重復使用；即，酶不用固定化，重復使用。
[0025] 可以將所得到的人參稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1與從人參根中提取的人參自 身皂苷酶復合物反應，在60~85°C反應1.5~10小時，分別提取反應液中皂苷，得到由20 (S)-人參二醇皂苷元、20 (R)-人參二醇皂苷元、其20-羥基脫水的20 (21 )，24-二烯人參二醇 皂苷元和20 (22 )，24-二烯人參二醇皂苷元的四種異構體組成的人參二醇皂苷元;或者得到 20(S)_人參三醇皂苷元、20(R)_人參三醇皂苷元、其20-羥基脫水的20(21) ,24-二烯人參三 醇皂苷元和20(22) ,24-二烯人參三醇皂苷元的四種異構體組成的人參三醇皂苷元。
[0026]所述人參稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1與從人參根中提取的人參自身皂苷酶復 合物的質量比是1: 〇. 1~10，所述反應體系中加有反應體積〇. 1~50%的甲酸、乙酸或梓檬 酸，人身稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1反應質量濃度0.1~10%。
[0027]所述人參自身皂苷酶復合物按如下方法制備:在所述a步驟提取人參二醇類皂苷 混合物和人參三醇類皂苷混合物后的人參渣中，加入人參渣干重的5~6倍水，在55~75°C 攪拌2~3小時，離心收集上清，在65°C以下高真空濃縮至波美度20~25,即為人參自身皂苷 酶復合物。
[0028]本發明是以曲霉菌微生物發酵得到的粗酶與人參二醇類皂苷(Rbl、Rb2、Rb3、Rc、 Rd皂苷的混合物)或人參三醇類皂苷(Re、Rgl、Rl皂苷的混合物)反應，反應中加入有機溶劑 并控制反應溫度，可高效制備人參稀有皂苷C-K和F1;所制備的人參稀有皂苷C-K或F1與人 參自身皂苷酶復合物反應，可分別制備四種異構體的人參二醇皂苷元和人參三醇皂苷元。 本發明產物得率及純度高(均90%以上），幾乎沒有副產物皂苷，無需進一步分離，操作簡單、 成本低，適合大批量生產;所得產品可用于藥物開發、人參制品、保健品和化妝品。
【附圖說明】
[0029]圖1是本發明實施例3制備的人參二醇皂苷元異構體HPLC圖。
[0030]圖2是本發明實施例4制備的人參三醇皂苷元異構體HPLC圖。
[0031]圖3是本發明實施例5所分離得到的人參二醇皂苷元HPLC圖。
[0032]圖4是本發明實施例6所分離得到的人參三醇皂苷元HPLC圖。
【具體實施方式】 [0033] 實施例1: a.以人參為原料，提取人參二醇類皂苷混合物和人參三醇類皂苷混合物： 人參(帶須根）1公斤，切片(2~4毫米厚），加入8升甲醇浸泡，在35~40°C，攪拌提取6~ 12小時，分離提取液，重復三次;過濾、合并提取液，減壓濃縮（回收甲醇）至比重波美度20， 加入500毫升石油醚、攪拌脫脂1小時，分離油脂層，重復2次。將脫脂后的人參提取液加3~5 倍體積的水稀釋，經1.5升體積的大孔樹脂(AB-8樹脂或者HP-20樹脂)柱中反復吸附皂苷， 用7.5~10升的去離子水洗脫柱，除糖等雜質;其吸附皂苷的大孔樹脂柱，用乙醇-水梯度洗 脫：乙醇濃度梯度為30%~84%，洗脫劑總體積11升，每300毫升分部收集：用TLC方法檢測皂 苷，其洗脫液前部分中含有原人參三醇類皂苷，洗脫液后部分中含有原人參二醇類皂苷;其 原人參三醇類皂苷部分、原人參二醇類皂苷部分，分別合并、分別減壓濃縮（回收乙醇）、干 燥，得到20.3克人參三醇類(PPT)皂苷，31.7克人參二醇類(PH))皂苷。
[0034]同樣的方法，甲醇或者70~80%的乙醇浸泡西洋參或者三七參，可分離提取原人參 二醇類皂苷和原人參三醇類皂苷。
[0035] 從人參或者西洋參根部中可提取4~8%的原人參二醇類皂苷和原人參三醇類皂 苷;從三七參根中可提取8~11%原人參二醇類皂苷和原人參三醇類皂苷。
[0036] b.以人參二醇類皂苷混合物為原料，與有機溶劑及緩沖液配制成底物溶液，再將 底物溶液與曲霉菌微生物發酵得到的粗酶液反應： 所述粗酶液按照如下常規方法制備： 將黑曲霉菌Aspergillus niger g.848菌（從大曲中分離得到的；文獻，劉春瑩等J Ginseng Research 2015，39，221-229。大連工業大學菌種保藏所，保藏號:Aspergillus niger g.848菌)接種于含0.03%的人參總皂苷的5%麥芽汁培養基中，28~33°C培養、通風攪 拌發酵4~6天，離心除渣;在上清液中加入75%飽和度的硫酸銨粉，在4°C過夜，沉淀酶蛋白， 收集酶蛋白沉淀；用0.01摩爾、PH5.0的醋酸緩沖液透析，再加入0.02摩爾、pH5.0的醋酸緩 沖液至十分之一的發酵液體積，即成粗酶液。
[0037] 上述所制備的人參原二醇類皂苷30克中加入90毫升甲醇和210毫升0.02摩爾、 PH5.0的醋酸緩沖液，攪拌溶解，再加入300毫升上述制備的粗酶液，在45°C攪拌反應30小 時。用TLC法檢測，反應液中沒有其他皂苷，90%以上為C-K皂苷。
[0038] c.提取反應液中皂苷，得到人參稀有皂苷C-K: 在反應液中加入2000毫升的甲醇混合，靜止過夜使酶蛋白沉淀，離心分離酶蛋白沉淀， 加入210毫升緩沖液，即成回收酶，重復使用，酶回收率可達70~90%以上。
[0039] 酶蛋白沉淀分離得到的上清液，經預先處理好的700毫升體積的D-280大孔脫色樹 脂柱脫色，再用1500毫升質量濃度80%的甲醇液洗脫樹脂柱內的皂苷，其脫色液減壓濃縮 (回收甲醇）后用300毫升水稀釋，再經700毫升體積的大孔樹脂柱(AB-8或HP-20樹脂）反復 吸附皂苷，用4200毫升的去離子水洗脫柱中的糖類等雜質，然后用3500毫升的質量濃度85 ~90 %甲醇洗脫皂苷，減壓濃縮，結晶、干燥，得16克反應產物人參稀有皂苷C-K，HPLC檢測， 其純度90%以上。
[0040] 上述反應中：從人參或者西洋參或者三七參根提取的人參二醇類皂苷(PPD)利用 含有機溶劑（丙醇、丙酮、乙醇或甲醇）的緩沖液（醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖 液），配制成人參二醇類皂苷的底物溶液;底物溶液的緩沖液pH為4.5~6.0，濃度為0.01~ 0.05M，有機溶劑質量濃度為5~40%;人參二醇類皂苷底物質量濃度為0.5~8%;將底物溶液 與粗酶液按照體積比1:0.1~1混合，在35~60°C反應16~40小時;所得產物幾乎都是C-K皂 苷，加入反應液2~4倍體積的有機溶劑(丙醇、丙酮、乙醇或甲醇)沉淀酶蛋白、離心收集酶 蛋白，溶解在原酶液質量濃度70~80%的pH5的醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖液中， 即為粗酶液可重復使用。
[0041] 離心分離酶蛋白的上清，經脫色大孔樹脂柱（柱體積，PPD皂苷原料重量的20倍體 積)脫色、減壓濃縮、回收有機溶劑，其濃縮液經大孔樹脂柱(柱體積，pro皂苷原料重的2〇倍 體積)反復吸附皂苷，用5~8倍柱體積的去離子水洗脫糖等雜質;再用4~6倍柱體積的質量 濃度80~96%的有機溶劑(丙醇、丙酮、乙醇或甲醇)洗脫皂苷，濃縮、結晶、干燥、同樣得到純 度90%以上的人參稀有皂苷C-K。
[0042] 實施例2: a. 以人參為原料，提取人參三醇類皂苷混合物同實施例1; b. 以人參三醇類皂苷混合物為原料，與有機溶劑及緩沖液配制成底物溶液，再將底物 溶液與曲霉菌微生物發酵得到的粗酶液反應： 所述粗酶液按照如下常規方法制備： 米曲霉菌Aspergillus oryzae sp.39g(從大曲中分離得到；文獻，王東明、魚紅閃等 Process Biochemistry2012, 47，133-138。大連工業大學菌種保藏所，保藏號： Aspergillus oryzae sp.39g)接種于裝有滅菌過的水分50%的1公斤麥麩的曲匣中（含50克 人參粉），在28~32°C、培養4~7天(每天攪拌4~6次），然后用5升的0.02摩爾、pH5.0的醋酸 緩沖液浸出酶;酶液離心，其上清液用硫酸銨固體沉淀酶蛋白；離心收集沉淀，溶解于500毫 升的0.02摩爾、pH5.0的醋酸緩沖液;即為粗酶液。
[0043]取實