)，檢測限為0.5ng mL-1。
[0025] 該測定方法的精密度通過對濃度為3ng ml/1的胰蛋白酶進行11次平行測定而計算 得出，相對標準偏差分別為2.1%，表明本發明的測定方法有較好的重現性。
[0026] 察了動物體內和運動小鼠胰腺組織樣品中常含有的凝血酶、胃蛋白酶、溶解酵素、 堿性磷酸酶、牛血清白蛋白、過氧化物氧化酶、葡萄糖氧化酶和血紅蛋白等成分對該方法測 定胰蛋白酶的選擇性。實驗結果表明，當胰蛋白酶的濃度為20ng ml/1時，誤差在5%的范圍 內1000倍的凝血酶、胃蛋白酶、溶解酵素、堿性磷酸酶、牛血清白蛋白、過氧化物氧化酶、葡 萄糖氧化酶和血紅蛋白均不干擾該方法對胰蛋白酶的響應。表明方法具有高的選擇性，本 方法具有應用到真實樣品檢測的可行性。
【附圖說明】
[0027]圖1.胰蛋白酶測定原理圖。
[0028]圖2.胰蛋白酶標準曲線圖。橫坐標是胰蛋白酶濃度，單位是ng ml/1，縱坐標Ipa為 DPV峰電流強度。
[0029] 圖3.方法對樣品的檢測結果。（A)凝血酶、（B)胃蛋白酶、（C)溶解酵素、（D)堿性磷 酸酶、(E)牛血清白蛋白、(F)過氧化物氧化酶、(G)葡萄糖氧化酶，（H)血紅蛋白和（I)胰蛋白 酶。
[0030] 具體實施方法
[0031] 以下是本發明涉及的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步作描述，但是本 發明的保護范圍并不限于這些實施例。凡不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本 發明的保護范圍之內。
[0032] 按照技術方案的步驟（1)至(4)得到胰蛋白酶標準曲線見圖2,其中亞甲基藍(MB); 巰基己醇(MCH)均購自阿拉丁試劑有限公司，胰蛋白酶、凝血酶、胃蛋白酶、溶解酵素、堿性 磷酸酶、牛血清白蛋白、過氧化物氧化酶、葡萄糖氧化酶和血紅蛋白購自Fluka公司。
[0033] 所用肽和DNA從北京賽百盛生物工程有限公司購得。
[0034]優選的，所述的肽的序列為GGRGGC。
[0035]優選的，所述的DNA1 部分序列為S'-TGA GGT AGT AGG TTG TAT AGT T-3'。
[0036] 優選的，所述的HI部分序列為S'-AGG GCG GGT GGG TTG TAT AGT AGG CAA AGT AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC ATG GGT-3'。
[0037] 優選的，所述的H2部分序列為S'-TGG GTA CTT TGC CTA CTA TAC AA T GAG GTA GTA GGT TGT ATA GTA GGG TAG GGC GGG-37 〇
[0038] 根據本發明的方法對行動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶含量進行了測定，并采用 標準加入法對方法進行了評價，樣品測定回收率為94.3-103.2%，測定結果見表1，本發明 的方法在胰蛋白酶檢測中具有精密度高的特點。
[0039] 表1小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶的測定結果。
[0040]
[0041 ] a7次測量結果 [0042] b單位:ng mL-1
[0043] 序列表 SFQl.RNCF. LISTING <li0>青島科技大學 <120> 一 ·種測定運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶的方法 <160> 4 ，170、Paicnlln version 3,3 <2!0> 1 <2\\> 22 <2\2> DNA <213>人工序列 <400> 1 TGAGGTAGTA GGrrG丁ATAG TT 22 <210> 2 <211> 57 <!12> DNA <213>人工系列 ，棚~2 AGGGCGCiGTCi GGTTGTATAG TAGGCAAAGT AACTATACAA CCTACTACCT CAIGGCir 57 <2Ι(?> 3 <211> 57 <212> DNA <213>人工序列 <400> 3 TGGGTACTTT Π(ΧΤΛ(、ΤΛΤΛ CAATGAGGTA GTAGGTTGTA mGmGGGm GGGCGGG 57 <210> 4 <211> 6 <2i2> PRT <213>人丄序列 <400> 1 G ly-G ly~ Arg~G I y~G ly-C ys 6 } 5
【主權項】
1. 一種測定運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶的方法，包括以下步驟： (1) 取0.1~20yg肽固體分散在含5 %戊二醛的PBS緩沖溶液中，持續攪拌2h后再向溶液 中加入1 OOyL濃度為0.1~1000m Μ的DNA1溶液，4°C振動孵育12h后，得肽修飾DNA1，即肽/ DNA1，4°C下保存； (2) 首先將金電極分別用1 · Own，0 · 3μπι，0 · 05μπι氧化鋁粉拋光，依次用蒸餾水，乙醇和蒸 餾水分別超聲5min，最后在0.謂的!1250 4溶液中進行循環伏安掃描直至電流電壓曲線穩定； 在潔凈的金電極表面滴加（1)所得的1~60yL肽/DNA溶液，在25 °C下組裝120min;修飾了肽/ DNA的金電極表面用去離子水洗凈三次，用高純氮氣吹干;然后將金電極浸入ImM的巰基己 醇溶液中，25°C下封閉60min，充分洗凈后得肽/DNA修飾金電極，4°C下保存備用； (3) 取1~60yL含0.001~400μΜ的H1和H2的混合溶液滴于(3)所得的肽/DNA修飾金電極 表面;在室溫下反應一段時間后，再用50yL的PBST溶液洗滌三遍;然后再取1~60yL含0.001 ~400mM的MB溶液滴于電極表面，在室溫下反應30分鐘后，再用50yL的TOST溶液洗滌三遍； 得HI、H2和MB自組裝肽/DNA修飾金電極； (4) 將1~60yL胰蛋白酶樣品溶液滴加到HI、H2和MB自組裝肽/DNA修飾金電極表面，在 室溫下反應30min;然后，用磷酸緩沖溶液反復沖洗電極表面三次；以上述所得電極為工作 電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極，利用差分脈沖伏安法DPV在磷酸緩沖 溶液中以1~l〇〇〇mV/ s的掃速進行掃描，電位掃描范圍為-0.4到-0.1 V;根據電化學信號對 胰蛋白酶進行定量； (5) 小鼠運動方式采用一次性力竭性游泳，水溫控制在32±1°C，小鼠游泳池規格為長 100cm X 50cm X 50cm，小鼠持續下沉十秒不能露出水面為力竭標準；小鼠斷頭取材，按1:10 加入勻漿介質后，將其制成組織勻漿，在3000轉/分鐘的條件下冷凍離心15min，取上清液按 (4)所述方法測定胰蛋白酶； 其中所述的肽的部分序列和DNA的部分序列如下： 所述的肽的部分序列為GGRGGC; 所述的DNA1 部分序列為5'TGA GGT AGT AGG TTG TAT AGT T-3'; 所述的HI部分序列為S'-AGG GCG GGT GGG TTG TAT AGT AGG CAA AGT AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC ATG GGT-37 ； 所述的H2部分序列為S'-TGG GTA CTT TGC CTA CTA TAC AA T GAG GTA GTA GGT TGT ATA GTA GGG TAG GGC GGG-37 〇2. 根據權利要求1的一種測定運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶的方法，其特征在于 所述的磷酸緩沖溶液配制方法為：在一升水中溶解〇 . 2g KH2P〇4和2.9g Na2HP〇4獲得0.1M PH7.4的磷酸緩沖液。3. 根據權利要求1的一種測定運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶的方法，其特征在于 所述的PBS配制方法為:將0.2g KH2P〇4、8.0g NaCl和0.2g KC1溶解于一升水中，得到0.15M pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液，即PBS。4. 根據權利要求1的一種測定運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶的方法，其特征在于 所述的PBSI1配制方法為:將磷酸緩沖溶液中加入Tween-20，使Tween-20的體積比為0 · 05%， 即得PBST溶液。
【專利摘要】本發明屬于電化學技術領域，以肽為識別單元和亞甲基藍為信號分子對胰蛋白酶含量進行檢測。利用利用戊二醛法，通過肽末端氨基與DNA氨基作用，將肽和DNA交聯，得肽/DNA；然后利用Au原子與肽末端巰基之間作用，將肽/DNA修飾在金電極表面；再加入H1和H2，發生雜交鏈式反應形成DNA雙鏈，然后加入亞甲基藍，亞甲基藍扦插在形成的DNA雙鏈中；當有目標物胰蛋白酶存在時，胰蛋白酶將肽切割導致扦插有亞甲基藍的DNA雙鏈從電極上脫落，電化學信號降低，根據電化學信號的強弱實現目標物胰蛋白酶的測定，建立了一種對運動小鼠胰腺組織樣品中胰蛋白酶高靈敏度特異性檢測的電化學方法，方法具有簡單，成本低，靈敏度高的特點。
【IPC分類】C12Q1/37
【公開號】CN105648033
【申請號】
【發明人】陳建春
【申請人】青島科技大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月23日