活力單位； NADP磷酸酶(U/mg prot) = (C雛fX V總）X (Aji賭-細{蹐）+ (Afi繼-Aset) + (V樣X Cpr) +Τ= 5 X (Α灘遭-細蹐）+ (Afi繼-Aset) + Cpr; 其中，A表示步驟7中各管的吸光值； C?隹t=0.5μηιο 1/mL，表示標準管的濃度； V總=0.5mL，表示酶促反應的總體積； V樣=0. lmL，表示加入樣本的體積； T=0.5h，表示反應時間； Cpr表示樣本蛋白質的濃度，單位為mg/mL。
[0014] 實施例2 一種NADP磷酸酶活性測定試劑盒，包括以下試劑： 提取液，1瓶，4°C保存，由5. lg蔗糖、52.6mgEDTA、0.3g牛血清白蛋白和lmg苯甲基磺酰 氟溶于濃度為5〇1111]1〇1/1^!1=7.4，體積為6〇111]^的1'1^8-!1(]1緩沖溶液后配制而成，置于6〇1]11^試 劑瓶中； 試劑一，液體X 1瓶，4°C保存，由0.182gTris溶于少量水后用冰乙酸調節pH=5.5，最后 用水定容至30mL配制而成，置于30mL試劑瓶中； 試劑二，粉劑X 5支，-20 °C保存，均由5.5mgNADP組成，置于lmL離心管中； 試劑三，粉劑X 1瓶，4°C保存，由2.5g抗壞血酸組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑四，粉劑X 1瓶，4°C保存，由0.625g鉬酸銨組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑五，液體X 1瓶，室溫保存，由3.47mL濃硫酸與21.53mL水混合而成，置于25mL試劑 瓶中； 試劑六，10mm〇l/L標準磷貯備液X 1瓶，4°C保存，由35.814mgNa2HP〇4 · 12H20溶于10mL 水后配制而成，置于10mL試劑瓶中。
[0015] 一種基于分光光度法且利用上述試劑盒測定NADP磷酸酶活性的方法，包括以下步 驟： 步驟1儀器和用品的準備； 準備可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、lmL玻璃比色皿、研缽、 冰和蒸餾水； 步驟2樣本的前處理； 按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1: (5~10)的比例(建議稱取約O.lg組織，加入lmL 提取液），進行冰浴勻漿，再采用離心率8000g，在4°C下，離心10min，取上清，置冰上待測； 步驟3試劑臨用前的準備； 1)在每支所述試劑二中加入1 mL所述試劑一，充分溶解備用，現配現用； 2 )在所述試劑三中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 3 )在所述試劑四中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 步驟4 0.5ymol/mL標準磷應用液配制： 將所述試劑六進行20倍稀釋，即取0.5mL所述試劑六加入9.5mL蒸餾水，充分混勻； 步驟5定磷試劑的配制； 按水:試劑三:試劑四：試劑五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色，若無 色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現用現配； 步驟6酶促反應；
1)在測定管和對照管中均加入300yL的所述試劑一和100yL的所述試劑二，并均在37°C (哺乳動物)或25°C (其它物種)下預熱5min; 2) 在所述測定管中再加入100此步驟2中前處理過的樣本，在所述對照管中再加入100μ L蒸餾水； 3) 將所述測定管在37°C (哺乳動物)或25°C (其它物種)下準確反應30min，接著沸水浴 5min(蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，再采用離心率lOOOOg，常溫下離心5min，最后取上清 液； 步驟7定磷；
1) 在標準管中加入100yL的0.5ymol/mL標準磷應用液和lOOOyL的定磷試劑，在空白管 中加入l〇〇yL的蒸餾水和lOOOyL的定磷試劑，在測定管中加入100yL步驟6中提取的上清液 和1 OOOyL的定磷試劑，在對照管中加入1 OOyL步驟6中提取的上清液和1 OOOyL的定磷試劑； 2) 將各管內的物質混勻，在37°C(哺乳動物)或25°C(其它物種)下分別水浴30min; 3) 然后將各管冷卻至室溫，接著將分光光度計的波長調節在660nm處，蒸餾水調零，記 錄各管吸光值； 步驟8根據步驟7中得出的各管吸光值，按樣本鮮重，計算NADP磷酸酶活性； 定義:每小時每g組織NADP磷酸酶分解NADP產生Ιμπιο?無機磷的量為一個NADP磷酸酶活 力單位； NADP磷酸酶（U/g鮮重) = (C_1=X V總）X (Α灘證-細贈)+ (Α標體-AsesO X V總+ (WX V樣+ 觸)+T=5 X (A灘遭-細蹐)+ (Afi繼-Aset) + ff; 其中，A表示步驟7中各管的吸光值； C?隹t=0.5μηιο 1/mL，表示標準管的濃度； V總=0.5mL，表示酶促反應的總體積； V樣=0. lmL，表示加入樣本的體積； V：tm=lmL，表示加入提取液的體積； T=0.5h，表示反應時間； Cpr表示樣本蛋白質的濃度，單位為mg/mL; W表示樣本的鮮重，單位為g。
[0016]上述實施例只是為了說明本發明的技術構思及特點，其目的是在于讓本領域內的 普通技術人員能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡 是根據本
【發明內容】
的實質所作出的等效的變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種NADP磷酸酶活性測定試劑盒，其特征在于，包括以下試劑： 提取液，1瓶，4°C保存，由蔗糖、EDTA、牛血清白蛋白和苯甲基磺酰氟溶于Tris-HCl緩沖 溶液后配制而成，置于60mL試劑瓶中； 試劑一，液體X 1瓶，4°C保存，由Tris溶于水與冰乙酸的混合液后配制而成，置于30mL 試劑瓶中； 試劑二，粉劑X 5支，-20 °C保存，均由NADP組成，置于lmL離心管中； 試劑三，粉劑X 1瓶，4°C保存，由抗壞血酸組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑四，粉劑X 1瓶，4°C保存，由鉬酸銨組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑五，液體X 1瓶，室溫保存，由濃硫酸與水混合而成，置于25mL試劑瓶中； 試劑六，10mmol/L標準磷貯備液X 1瓶，4°C保存，由Na2HP〇4 · 12H20溶于水后配制而成， 置于10mL試劑瓶中。2. 根據權利要求1所述的NADP磷酸酶活性測定試劑盒，其特征在于： 所述提取液中，Tris-HCl緩沖溶液的濃度為50mmol/L，pH=7.4，體積為60mL，蔗糖的質 量為5. lg，EDTA的質量為52.6mg，牛血清白蛋白的質量為0.3g，苯甲基磺酰氟的質量為lmg; 所述試劑一中，Tris的質量為0.182g，Tris溶于水后與冰乙酸的混合液的pH=5.5，體積 為30mL; 所述試劑二中，每支離心管內的NADP的質量均為5.5mg; 所述試劑三中，抗壞血酸的質量為2.5g; 所述試劑四中，鉬酸銨的質量為〇.625g; 所述試劑五中，濃硫酸的體積為3.47mL，水的體積為21.53mL; 所述試劑六中，Na2HP〇4 · 12H20的質量為35.814mg，水的體積為10mL。3. -種采用如權利要求2所述的試劑盒的NADP磷酸酶活性測定方法，其特征在于，基于 分光光度法，包括以下步驟： 步驟1儀器和用品的準備； 準備可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、lmL玻璃比色皿、研缽、 冰和蒸餾水； 步驟2樣本的前處理； 按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1: (5~10)的比例，進行冰浴勻漿，再采用離心率 8000g，在4°C下，離心10min，取上清，置冰上待測； 步驟3試劑臨用前的準備； 1) 在每支所述試劑二中加入1 mL所述試劑一，充分溶解備用，現配現用； 2) 在所述試劑三中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 3) 在所述試劑四中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 步驟4 0.5ymol/mL標準磷應用液配制： 將所述試劑六進行20倍稀釋，即取0.5mL所述試劑六加入9.5mL蒸餾水，充分混勻； 步驟5定磷試劑的配制； 按水:試劑三:試劑四：試劑五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色，若無 色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現用現配； 步驟6酶促反應； 在測定管和對照管中均加入300yL的所述試劑一和lOOyL的所述試劑二，并均在37°C或 25°C下預熱5min; 在所述測定管中再加入l〇〇yL步驟2中前處理過的樣本，在所述對照管中再加入100yL 蒸餾水； 將所述測定管和對照管均在37°C或25°C下準確反應30min，接著沸水浴5min，冷卻后， 再采用離心率l〇〇〇〇g，常溫下離心5min，最后取上清液； 步驟7定磷； 1)在標準管中加入100yL的0.5ymol/mL標準磷應用液和lOOOyL的定磷試劑，在空白管 中加入l〇〇yL的蒸餾水和lOOOyL的定磷試劑，在測定管中加入100yL步驟6中提取的上清液 和1 OOOyL的定磷試劑，在對照管中加入1 OOyL步驟6中提取的上清液和1 OOOyL的定磷試劑； 2 )將各管內的物質混勻，在37 °C或25 °C下分別水浴30min; 3)然后將各管冷卻至室溫，接著將分光光度計的波長調節在660nm處，蒸餾水調零，記 錄各管吸光值； 步驟8根據步驟7中得出的各管吸光值，計算NADP磷酸酶活性； 1) 按組織蛋白濃度計算： NADP磷酸酶（U/mg prot) = (C灘fXV總）X (Aji隨-細贈）+ (Afi繼-Ases〇 + (V樣XCpr)+T= 5 X (A灘遭-細蹐）+ (Afi繼-Aset) + Cpr; 2) 按樣本鮮重計算： NADP磷酸酶（U/g鮮重）= (C雛s=XV總）X (Ai隨-A_置）+ (A標賴=-Ases〇 XV總+(WX V樣+ 觸)+T=5 X (A灘遭-細蹐)+ (Afi繼-Aset) + ff; 其中，A表示步驟7中各管的吸光值； C?隹t=0.5μηιο 1/mL，表示標準管的濃度； V總=0.5mL，表示酶促反應的總體積； V樣=0. lmL，表示加入樣本的體積； V：tm=lmL，表示加入提取液的體積； T=0.5h，表示反應時間； Cpr表示樣本蛋白質的濃度，單位為mg/mL; W表示樣本的鮮重，單位為g。
【專利摘要】本發明公開了一種NADP磷酸酶活性測定試劑盒及其方法，該試劑盒包含的試劑有：提取液一瓶，由Tris溶于水與冰乙酸的混合液后配制成的試劑一瓶，由NADP組成的粉劑五支，由抗壞血酸組成的試劑一瓶，由鉬酸銨粉劑一瓶，由濃硫酸與水混合成的液體一瓶，10mmol/L標準磷貯備液一瓶。本發明的方法是基于分光光度法，并通過鉬酸銨定磷法來間接測定NADP磷酸酶活性，相比孔雀綠定磷法，測定范圍更廣泛，測定管吸光值和標準管吸光值比對即可計算出NADP磷酸酶活性，適用于測定不同NADP磷酸酶活性的樣品，因此不需要將樣品進行稀釋。本發明的試劑盒所用試劑均為常用試劑，成本極低。本發明的試劑盒不僅檢測方便，快速，而且可同時測定多個樣本，顯色后24小時內，重復性較好。
【IPC分類】C12Q1/42
【公開號】CN105648034
【申請號】
【發明人】趙林川
【申請人】蘇州科銘生物技術有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月31日