一種α-醋酸萘酚酯酶染色試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，具體涉及α_醋酸萘酚酯酶(α-ΝΑΕ)染色液（化學染色 法），即一種α-醋酸萘酚酯酶染色試劑盒。
【背景技術】
[0002] 細胞化學染色技術是結合細胞學和化學，以形態學為基礎，通過化學染色處理，在 顯微鏡下對細胞內的酶類、脂類、糖類、蛋白質、核酸等成分進行定性、定量、定位分析的一 種技術。該技術應用于血液和骨髓涂片及淋巴結組織切片，在血細胞的識別、血液病診斷和 鑒別診斷中發揮重要的作用。目前，常用的與血液系統疾病有關的細胞化學染色有過氧化 物酶染色、糖原染色、酯酶染色、堿性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色及鐵染色等。
[0003] 單核細胞來源于骨髓中的造血干細胞，前髓細胞是單核細胞的前體。單核細胞作 為血液中的清道夫細胞，具有活躍的吞噬或卷入外來物如細菌等，并將其清除的作用。單核 細胞數量的增多見于血液紊亂(如急性或慢性感染）、熱帶疾病(如梅毒、錐蟲病、肺結核）、 骨髓增生異常疾病及單核細胞系白血病等。
[0004] 與其他血細胞比較，單核細胞內含有更多的非特異性酯酶。非特異性酯酶是血細 胞中作用于短鏈脂肪酸的酯酶。根據酯酶水解的底物不同，血細胞中常見酯酶包括醋酸 萘酸酯酶( a_naphthol acetate esterace ,α-NAE)、乙酸AS-D萘酸酯酶、醋酸AS萘酸酯酶、 氯化醋酸AS-D萘酚酯酶等。非特異性酯酶α-ΝΑΕ主要存在于單核系細胞中，被稱之為單核細 胞型酯酶，其活性測定及氟化鈉 (NaF)抑制試驗主要用于急性單核細胞白血病與急性粒細 胞白血病的鑒別，對診斷單核細胞相關疾病具有重要作用。
[0005] 采用化學染色法對血細胞中α-醋酸萘酚酯酶進行染色測定，其原理是α-ΝΑΕ能將 基質液中的醋酸萘酚水解，產生α-萘酚，再與重氮染料偶聯，形成不溶性的有色沉淀，定 位于胞質內酶活性處，沉淀物顯色的深淺與α-ΝΑΕ活性呈正比。因所用的重氮鹽不同，陽性 反應的沉淀可分灰黑色或棕黑色。α-ΝΑΕ在正常單核-吞噬細胞系統中含量較高，可呈陽性 或強陽性反應，且可被NaF抑制。正常粒細胞部分呈弱陽性或陽性反應，但不被NaF所抑制。 正常幼紅細胞、巨核細胞、部分淋巴細胞均能見到弱陽性。在白血病細胞的FAB亞型分型中， 依據陽性反應及NaF抑制率可鑒定M1-M5可能性。
[0006] 在現有的血細胞α-ΝΑΕ染色中，重氮染料常使用堅固藍B鹽、固紫鹽等，使用甲基綠 或蘇木素進行復染，單核細胞的α-ΝΑΕ活性表現為強陽性，而未成熟粒細胞如myelocytes和 metamyelocy tes也能顯示陽性反應，早幼粒細胞白血病(M3)陽性強度可比急性單核細胞白 血病(M5 )、急性粒-單核細胞白血病(M4)更高。現有染色方法可以觀察α-ΝΑΕ活性強弱，但在 急性白血病分型時，現有染色方法難以直接區分單核細胞和早幼粒細胞，需要通過NaF抑制 試驗來區分單核細胞系和粒細胞系白血病，而NaF抑制率大小的判斷受人為主觀因素影響 較大，常給白血病分型和鑒別帶來一定困擾。
【發明內容】
[0007] 有鑒于此，本發明的目的在于提供α-醋酸萘酚酯酶(α-ΝΑΕ)染色液(化學染色法）， 即醋酸萘酚酯酶染色試劑盒，使所述試劑盒應用于檢測時能夠根據細胞核染后的顏色區 分出單核細胞和早幼粒細胞，無需經NaF抑制試驗即可快速輔助診斷出單核細胞白血病和 粒細胞白血病。
[0008] 本發明的另一個目的在于提供一種α-醋酸萘酚酯酶染色試劑盒，使所述試劑盒應 用于檢測時縮短染色時間，提高檢測效率。
[0009 ]為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0010] -種α-醋酸萘酚酯酶染色試劑盒，包括固定液、α-醋酸萘酚酯溶液、偶氮染料溶 液、緩沖液及漂洗液，所述偶氮染料溶液為堿性藍54水溶液。
[0011] 針對現有α-ΝΑΕ染色法無法區分單核細胞和早幼粒細胞，需要額外借助NaF抑制試 驗診斷單核細胞白血病和粒細胞白血病以及檢測過程中染色時間過長的缺陷，本發明選擇 堿性藍54作為本發明試劑盒的偶氮染料，堿性藍54具有如下化學結構：
[0012]
[0013] 在現w萬法中，里m染科芾便用豎回監B鹽、回紫鹽等，最后處米用甲基綠或蘇木 素復染，本發明采用水溶性季偶氮染料堿性藍54,不僅能與細胞內酯酶水解產物α-萘酚產 生黑色沉淀，還可以將單核細胞的細胞核染成紅紫色，而其他細胞如粒細胞、淋巴細胞等的 細胞核為棕色或深棕色，從而能夠更直觀、更準確地顯示、鑒別出單核細胞，并消除粒細胞 對單核細胞系鑒別的干擾影響，同時無需進行復染程序。
[0014] 在本發明所述試劑盒中，所述固定液可以采用同類方法或試劑盒中常用的固定 液，例如甲醛類的固定液，而本發明給出了采用甲醛-丙酮磷酸鹽緩沖液作為固定液優選方 案，其pH值范圍為6.0-7.0，在本發明的【具體實施方式】中該pH值可以具體選擇為6.6。更為優 選地，所述固定液中的磷酸鹽緩沖液以Na 2HP〇4 · 12H20、KH2P〇4來配制，繼而再和甲醛、丙酮 混合配制。更為優選地，固定液中甲醛和丙酮的體積比為5:9。
[0015] 本發明試劑盒中的α_醋酸萘酚酯溶液優選采用α_醋酸萘酚酯的丙酮水溶液，其中 醋酸萘酚酯質量體積百分比濃度為0.5-1.5 % (α-醋酸萘酚酯質量/α-醋酸萘酚酯溶液體 積的百分比），丙酮體積百分比濃度為40%_60% (丙酮體積/α-醋酸萘酚酯溶液體積的百分 比）。在本發明具體的實施方式中，α-醋酸萘酚酯質量體積百分比濃度為1.0%，例如100mg 醋酸萘酚酯溶于10mL丙酮水溶液中即為1.0%濃度，其他類似的描述方式均可換算成α-醋酸萘酚酯質量體積百分比濃度;而丙酮體積百分比濃度在【具體實施方式】中為50%。
[0016] 本發明所述堿性藍54水溶液中堿性藍54質量體積百分比濃度為0.5-5.0% (堿性 藍54質量/堿性藍54水溶液體積的百分比）。在本發明的【具體實施方式】中堿性藍54質量體積 百分比濃度為3.0%，例如300mg堿性藍54溶于10ml蒸餾水即為3.0%濃度，其他類似的描述 方式均可換算成堿性藍54質量體積百分比濃度。
[0017] 本發明所述緩沖液也叫基礎液，優選采用磷酸鹽緩沖液，摩爾濃度為0.04-0.08M， pH值為7.0-8.0。在本發明的【具體實施方式】中，所述緩沖液為pH7.6的0.067M磷酸鹽緩沖液， 以Na2HP〇4 · 12Η20、ΚΗ2Ρ〇4來配制。
[0018] 本發明所述漂洗液優選酸性緩沖液，可選自醋酸-醋酸鈉緩沖液、檸檬酸-檸檬酸 鈉緩沖液、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中的一種，摩爾濃度可選擇為〇. 05Μ-0.15Μ，ρΗ 值范圍為2.0~6.0。在本發明的【具體實施方式】中，所述漂洗液為ρΗ3.6的0.1Μ醋酸-醋酸鈉 緩沖液。
[0019] 以本發明提供的試劑盒進行α-ME染色時的步驟可參照如下：
[0020] 步驟1:取干燥的新鮮血涂片標本，滴加固定液5~8滴，蓋滿血膜即可，（4°C )30s， 水洗；
[0021] 步驟2:將試劑盒中α-醋酸萘酚酯溶液、偶氮染料溶液置入緩沖液中，混勻后即為 基質液，將涂片置入基質液中，37°C染色20min后，吸水紙吸掉多余的染料；
[0022] 步驟3:染色的血涂片置入漂洗液2s后，立即用吸水紙吸干漂洗液，血涂片用水漂 洗3次，待干后即可進行鏡檢。
[0023]上述步驟2中所述基質液中α-醋酸萘酚酯的參考濃度為0.1-0.5mg/mL，堿性藍54 與α_醋酸萘酚酯的參考摩爾濃度比為1:1~4:1，但不僅限于上述所述參考濃度和比例，可 視具體檢測環境調整。
[0024]以本發明提供的試劑盒檢測急性單核細胞白血病(Μ5)和急性早幼粒細胞白血病 (M3)患者血細胞，鏡檢結果顯示Μ5型白血病血細胞中單核細胞系細胞核為亮紅紫色，細胞 質為紅紫色，且單核細胞內α-醋酸萘酚酯酶處形成黑色顆粒沉淀;M3型白血病血細胞中早 幼粒細胞系細胞核為棕色或深棕色，胞質內α-醋酸萘酚酯酶處形成黑色顆粒沉淀。檢測結 果表明本發明試劑盒染色后鏡檢可以直接區分單核細胞和早幼粒細胞。
[0025]而采用現有的α-ΝΑΕ染色方法時，Μ5型白血病血細胞中單核細胞系細胞核為綠色， 單核細胞內α-醋酸萘酚酯酶處形成黑色沉淀;M3型白血病血細胞中早幼粒細胞系細胞核為 綠色，胞質內α-醋酸萘酚酯酶處形成黑色顆粒沉淀。檢測結果表明現有的方法無法直接區 分單核細胞和早幼粒細胞，需要借助NaF抑制試驗進一步區分。