一種L-天冬氨酸β-脫羧酶產生菌的高通量篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物制藥領域，涉及一種L-天冬氨酸β_脫羧酶產生菌的高通量篩 選方法。
【背景技術】
[0002] L-天冬氨酸β -脫羧酶（Asd)，又稱L-天冬氨酸1-脫羧酶，能催化脫去L-天冬 氨酸的羧基，生成L-丙氨酸（L-Ala)。L-丙氨酸在醫藥和食品工業上的應用相當廣泛，隨 著需求量的增加和發酵工業的發展，L-丙氨酸的生產方法由蛋白質水解提取法、發酵法發 展到酶法生產，即利用L-天冬氨酸β -脫羧酶將L-天冬氨酸脫羧生成L-丙氨酸。用Asd 轉化生產L-Ala可分為游離細胞法和固定化細胞轉化法。日本已經在1982年用卡拉膠固 定Pseudomonas, dacunhae細胞用于L-Asp連續生產L-Ala。國內劉景晶等（參見高麗娟等 人于2007年在《工業微生物》37 (5) :54-59中發表的文章）用卡拉膠固定含有Asd活性的 Pseudomonas, dacunhae 細胞，在 ρΗ6· 2 ~ρΗ7· 25 范圍內和底物濃度為 0· 4mol/L_0. 5mol/L 時，固定化細胞表現出最高酶活力。
[0003] 然而在L-丙氨酸酶法轉化過程中，脫羧反應使反應液pH值不斷上升，偏離了酶反 應的最適pH值范圍，導致細胞的酶活力降低，這對工藝過程控制和生物反應器提出更高要 求。由于海洋微生物具有陸生微生物無法比擬的生態群落結構多樣性和物種多樣性，所以 從海洋環境中篩選具有特殊耐受性質的生物酶產生菌是目前微生物領域研究的特點，本發 明基于該理念，建立了從海洋生境中快速篩選L-天冬氨酸β -脫羧酶的高通量方法，并且 篩選的菌株具有耐堿性能，在細胞生產過程中避免了繁瑣pH值控制步驟。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌的高通量篩選方法。
[0005] 本發明所提供的L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌的高通量篩選方法，具體而言，可 包括如下步驟：
[0006] 1)采用富集培養基對樣品中的微生物進行富集培養與初步分離；
[0007] 2)將步驟1)分離得到的單菌落穿刺接種微孔板初篩半固體培養基，培養后根據 培養基的渾濁程度篩選L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌；
[0008] 3)將步驟2)初篩得到的菌株接種微孔板液體培養，收集菌體進行生物轉化，采用 紙層析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β -脫羧酶高產菌株；
[0009] 4)將步驟3)復篩得到的高產菌株進行搖瓶發酵培養，收集菌體進行生物轉化，然 后氧化顯色法測定L-天冬氨酸β -脫羧酶酶活性。
[0010] 在上述方法中，步驟1)中，所述微生物樣品來自海綿、珊瑚、海底淤泥，所述富集 培養基含有質量百分含量1 % _2 %的NaCl ;
[0011] 步驟2)中，所述初篩半固體培養基含有質量百分含量0. 05 %的CaCl2 ;
[0012] 步驟3)中，所述生物轉化的操作方式為：將步驟2)初篩得到的菌株接種到復篩 培養基，20°C -37°C恒溫培養后離心收集菌體，與生物轉化液混合，混合物20°C -37°C孵育 12-24小時；
[0013] 步驟4)中，所述生物轉化的操作方式為：將步驟3)復篩得到的菌株接種到搖瓶發 酵培養基，20°C -37°C恒溫培養后離心收集菌體，與生物轉化液混合，混合物20°C -37°C孵 育12-24小時；
[0014] 在上述方法中，步驟1)中所述富集培養的方式為：將微生物樣品用富集培養基洗 滌三次，然后接種到富集培養基，溫度20°c -37°c、轉速100-200轉/分鐘振蕩培養2-4天； 所述富集培養基各組分的質量百分含量為：牛肉膏0. 5%，蛋白胨1%，酵母粉0. 2%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，NaCl 1. 5%，pH 8. 5-9. 0。
[0015] 步驟3)中，所述復篩培養基各組分的質量百分含量為：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵 母粉 0· 2%，NaCl 1. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，MgS04 · 7H20 0· 03%，CaCl2 0· 05%，pH8. 5-9. 0。
[0016] 步驟4)中，所述搖瓶發酵培養基各組分的質量百分含量為：葡萄糖3%，蛋白胨 1%，酵母粉 0.2%，NaCl 1.5%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%，Κ2ΗΡ04·Η20 0.14%，MgS04*7H20 0.03%， CaCl20. 05%, pH 8. 5-9. 0〇
[0017] 步驟3)與步驟4)中，所述生物轉化液各組分的質量百分含量為：L-天冬氨酸 2%，ΚΗ 2Ρ040· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，ρΗ8· 5-9. 0。
[0018] 本發明的再一個目的是提供一種L-天冬氨酸β-脫羧酶產生菌的初篩半固體 培養基。所述初篩半固體培養基各組分的質量百分含量為：L-天冬氨酸2%，葡萄糖3%， 蛋白胨 1%，酵母粉 0.2%，NaCl 1.5%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%, Κ2ΗΡ04·Η20 0.14%，MgS04*7H20 0. 03%，CaCl2 0. 05%，瓊脂0. 8%，pH8. 5-9. 0 ;將所述初篩半固體培養基分裝于96孔酶標 板，制得初篩半固體培養基孔板。
[0019] 所述初篩半固體培養基在對耐堿L-天冬氨酸β-脫羧酶產生菌的高通量篩選中 的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0020] 本發明提供的L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌高通量篩選方法，可以用于快速篩選 具有耐堿性能的L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌，以解決酶法生產L-A la過程中pH值不斷 上升酶活性降低的問題，省略工藝過程不斷調節pH值步驟；該高通量篩選方法填補了目前 國內在該方面研究的空白，同時也為同類生物酶產生菌的高通量篩選提供參考。
【具體實施方式】
[0021] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可從商業途徑購買。
[0022] 實施例1 L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌的篩選
[0023] -、樣品中微生物的富集與分離
[0024] 富集培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%，Κ2ΗΡ04·Η20 0· 14%，NaCl 1· 5%，pH 7· 0-7. 2,121°C滅菌 20min，冷卻后備用；
[0025] 分離培養基平板：牛肉膏0.5%，蛋白胨l%，NaCl 1.5%，瓊脂2%，pH 8.5-9. 0， 121°C滅菌20min，然后倒平皿制作分離平板，20mL/皿，冷卻凝固后待用；
[0026] 1、采樣
[0027] 文獻報道海洋微生物具有陸生微生物無法比擬的生態群落結構多樣性和物種多 樣性，故選取了煙臺黃海海域作為采樣地點，采集了海綿、珊瑚、海底淤泥等共10個樣品。
[0028] 2、富集
[0029] 樣品取回實驗室后，將樣品用100mL富集培養基洗滌三次，然后置于1000mL無菌 三角瓶中，溫度30°C、轉速150轉/分鐘振蕩培養3d，該步驟可將樣品中的微量微生物進行 富集培養。
[0030] 3、平板分離
[0031] 將富集后的菌液用無菌生理鹽水十倍梯度稀釋后涂布分離培養基平板，30°C培養 3d，作為篩選L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌的菌種資源庫。
[0032] 二、96微孔板穿刺培養初篩
[0033] 1、初篩培養基孔板的制備
[0034] 初篩半固體培養基配方：L-天冬氨酸2%，葡萄糖3%，蛋白胨1 %，酵母粉0. 2%， NaCll. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · Η20 0· 14%，MgS04 · 7Η20 0· 03%，CaCl2 0· 05%，瓊脂 0. 8%, pH 8. 5-9. 0〇
[0035] 將初篩半固體培養基121°C滅菌20min，冷卻至50°C左右，然后采用96孔酶標板制 備初篩培養基孔板，即向酶標板的每個微孔中加入300 μ L初篩培養基，冷卻凝固后備用。
[0036] 2、穿刺培養初篩
[0037]用無菌牙簽從步驟一涂布的分離平板中逐個挑取單菌落，穿刺接種初篩培養基孔 板，總共接種480株，30°C培養16h，觀察微孔中培養基的透明度，L-天冬氨酸β -脫羧酶產 生菌所在的微孔培養基變渾濁，根據渾濁程度判定L-天冬氨酸β -脫羧酶的活性。
[0038] 其實驗原理為：穿刺菌株所產生的L-天冬氨酸β-脫羧酶作用于培養基中的 L-天冬氨酸，脫羧產生的C02，在半固體培養基中呈離子態C032，C0 32與培養基中的Ca2+反 應生成難溶的CaC03，可使培養基變渾濁，故可根據渾濁程度粗略判定L-天冬氨酸β -脫羧 酶的活性，該法快速簡捷，可在96微孔板中實現高通量的初篩。
[0039] 本實施例選取了 24株渾濁度較高的菌株，進入下一步的復篩。
[0040] 三、24孔板液體培養結合紙層析復篩
[0041] 1、復篩培養基孔板的制備
[0042] 復篩培養基配方：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母粉0. 2%，NaCl 1.5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05 %，Κ2ΗΡ04 · Η20 0· 14 %，MgS04 · 7Η20 0· 03 %，CaCl2 0· 05 %，ρΗ8· 5-9. 0。
[0043] 將復篩培養基121°C滅菌20min，冷卻后向24孔細胞培養板的每個微孔中加入 500 μ L復篩培養基即得復篩培養基孔板。
[0044] 2、生物轉化
[0045] 生物轉化液：L-天冬氨酸 2%，ΚΗ2Ρ04 0· 05