r>[0026]同時，現有的α-ΝΑΕ染色通常需要1小時左右，復染需要5分鐘左右，而采用本發明 試劑盒僅需一次染色，染色時間為20分鐘左右，顯著縮短了檢測時間，提高了檢測效率。 [0027]由以上技術方案可知，本發明試劑盒以堿性藍54替代現有α-ΝΑΕ染色方法中的堅 固藍Β鹽、固紫鹽等重氮染料，將染色時間縮短到20分鐘左右，而且染色后鏡檢可直接區分 單核細胞和未成熟及成熟粒細胞、淋巴細胞、紅細胞，省去細胞核復染步驟，無需NaF抑制 試驗輔助即可快速診斷出單核細胞白血病和粒細胞白血病，相比現有方法更加簡便、快捷。
【附圖說明】
[0028]圖1所示為用本發明試劑盒染色的M5型白血病患者的血細胞涂片；
[0029] 圖2所示為用本發明試劑盒染色的M3型白血病患者的血細胞涂片；
[0030] 圖3所示為用現有常規方法染色的M5型白血病患者的血細胞涂片；
[0031]圖4所示為用現有常規方法染色的M3型白血病患者的血細胞涂片。
【具體實施方式】
[0032]本發明實施例公開了一種α-醋酸萘酚酯酶染色試劑盒。本領域技術人員可以借鑒 本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技 術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的試劑盒已經通過較佳實 施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的產品 及方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0033] 為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的一種α-醋酸萘酚酯酶染 色試劑盒進行詳細說明。
[0034] 實施例1:本發明試劑盒及染色方法
[0035] 1、本發明試劑盒的組成及制備方法
[0036] 固定液：稱取20mg Na2HP〇4 · 12H20、100mg ΚΗ2Ρ〇4,加入蒸餾水30ml，溶解后加入 4 5m 1丙酮和2 5m 1甲醛，混勾后調節pH值為6.6。
[0037] α-醋酸萘酸酯溶液:稱取l〇〇mga-醋酸萘酸酯溶于l〇ml 50%丙酮水溶液。
[0038]偶氮染料溶液:稱取300mg堿性藍54溶于10ml蒸餾水，顏色為深紅色。
[0039] 緩沖液(基礎液）：pH7.6的0.067M磷酸鹽緩沖液。
[0040] 配制方法:A液:稱取2.388g Na2HP〇4 · 12H20加蒸餾水溶解定容至100ml;B液:稱取 0.908g KH2P〇4加蒸餾水溶解定容至100ml。取A液87ml、B液13ml混勻，即得。
[00411漂洗液:pH3.6的0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液。
[0042] 配制方法:A液:取3.0ml冰醋酸溶于497ml蒸餾水，配制成0.1M冰醋酸溶液;B液:稱 取1.36g三水合乙酸鈉溶于80ml蒸餾水，溶解后蒸餾水定容至100ml，配制成0.1M醋酸鈉。取 A液185ml、B液15ml混勻后，即得。
[0043] 2、本發明染色試劑盒的染色方法
[0044] (1)取干燥的新鮮血涂片標本，滴加固定液5~8滴，蓋滿血膜即可，（4 °C ) 30s，水 洗。
[0045] (2)將實施例1所得lmLa-醋酸萘酚酯溶液和lmL偶氮染料溶液置于28mL緩沖液中， 混勻后即為a-NAE基質液。將混勻的a-NAE基質液轉移至染缸內，將涂片置入染缸中，37°C染 色20min后，吸水紙吸掉多余的染料。
[0046] (3)染色的血涂片置入漂洗液2s后，立即用吸水紙吸干漂洗液。血涂片用水漂洗3 次，待干后即可進行鏡檢。
[0047] 實施例2:現有常規a-NAE染色方法
[0048] 1、常規染色試劑的組成及制備方法
[0049] 作用液:0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7.6)50ml，a-醋酸萘酚酯lOOmg溶解于lml 50%丙 酮水溶液，充分振蕩，直至最初產生的混濁物大部分消失為止，加重氮鹽(堅固藍B)50mg振 蕩，過濾后使用。
[0050] 復染液：l〇g/L甲基綠水溶液。
[0051 ] 2、染色方法
[0052] (1)固定:新鮮涂片置甲醛蒸汽熏5~10分鐘。
[0053] (2)水流沖洗5分鐘。
[0054] (3)入作用液(37 °C) 1小時，水洗。
[0055] (4)10g/L甲基綠水溶液復染5分鐘。
[0056] (5)水洗、干后鏡檢。
[0057] 實施例3:本發明試劑盒染色與現有常規染色方法的比較
[0058] 采用本發明實施例1試劑盒以及按照實施例2的現有常規染色方法對急性單核細 胞白血病(M5)和急性早幼粒細胞白血病(M3)患者血細胞進行染色，結果見圖1-圖4。
[0059] 本發明染色結果，M5型白血病血細胞中單核細胞系細胞核為亮紅紫色，細胞質為 紅紫色，且單核細胞內α-醋酸萘酚酯酶處形成黑色顆粒沉淀;M3型白血病血細胞中早幼粒 細胞系細胞核為棕色或深棕色，胞質內醋酸萘酚酯酶處形成黑色顆粒沉淀。
[0060] 現有方法染色結果，Μ5型白血病血細胞中單核細胞系細胞核為綠色，單核細胞內 α_醋酸萘酚酯酶處形成黑色沉淀;M3型白血病血細胞中早幼粒細胞系細胞核為綠色，胞質 內α-醋酸萘酚酯酶處形成黑色顆粒沉淀。
[0061] 綜合上述兩種染色結果可知，M3和Μ5白血病患者的血細胞用常規方法染色，難以 從染色涂片區分出單核細胞和早幼粒細胞，對白血病進行分型，需要通過平行NaF抑制實驗 來區分，M5單核細胞中陽性NaF抑制率較高，M3早幼粒細胞的NaF陽性抑制率較低。而采用本 發明染色試劑盒染色，在不需做平行NaF抑制實驗下，根據細胞核染后的顏色能區分出單核 細胞和早幼粒細胞，從而可以快速輔助診斷出單核細胞白血病和粒細胞白血病，且染色時 間只需20min就可完成染色，整個操作染色時間縮短。
[0062]以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對 于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行 若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種α-醋酸萘酚酯酶染色試劑盒，其特征在于，包括固定液、α-醋酸萘酚酯溶液、偶 氮染料溶液、緩沖液及漂洗液，所述偶氮染料溶液為堿性藍54水溶液。2. 根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述固定液為甲醛-丙酮磷酸鹽緩沖液，pH 值范圍為6.0-7.0。3. 根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述甲醛和丙酮的體積比為5:9。4. 根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述α-醋酸萘酚酯溶液為α-醋酸萘酚酯的 丙酮水溶液。5. 根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述α-醋酸萘酚酯溶液中α-醋酸萘酚酯質 量體積百分比濃度為〇. 5-1.5%，丙酮體積百分比濃度為40%_60%。6. 根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述堿性藍54水溶液中堿性藍54質量體積 百分比濃度為0.5-5.0%。7. 根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，摩爾濃度為 0 · 04-0 · 08Μ，pH 值為 7 · 0-8 · 0。8. 根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述漂洗液為酸性緩沖液。9. 根據權利要求8所述試劑盒，其特征在于，所述酸性緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖液、檸 檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中的一種。10. 根據權利要求8或9所述試劑盒，其特征在于，所述酸性緩沖液摩爾濃度為0.051_ 0·15Μ，ρΗ值范圍為2.0~6.0。
【專利摘要】本發明涉及生物技術領域，公開了一種α-醋酸萘酚酯酶染色試劑盒。本發明所述試劑盒包括固定液、α-醋酸萘酚酯溶液、偶氮染料溶液、緩沖液及漂洗液，所述偶氮染料溶液為堿性藍54水溶液。本發明試劑盒以堿性藍54替代現有α-NAE染色方法中的堅固藍B鹽、固紫鹽等重氮染料，將染色時間縮短到20分鐘左右，染色后即可通過鏡檢區分單核細胞和未成熟及成熟粒細胞、淋巴細胞、紅細胞，省去細胞核復染步驟，且無需NaF抑制試驗輔助即可快速診斷出單核細胞白血病和粒細胞白血病，相比現有方法更加簡便、快捷。
【IPC分類】C12Q1/44
【公開號】CN105648035
【申請號】
【發明人】謝永華, 朱美萍, 許付
【申請人】上海太陽生物技術有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月7日