%，Κ2ΗΡ04 · Η20 0· 14%，pH 8. 5-9. 0。
[0046] 生物轉化反應：將步驟二初篩得到的24株菌株接種到復篩培養基孔板，30°C培養 箱中靜置培養24h，離心收集菌體，用生物轉化液洗滌后再與0. 5mL生物轉化液混合，混合 物30°C孵育24h，離心取上清分析生成的L-丙氨酸。
[0047] 3、紙層析半定量分析L-丙氨酸含量
[0048] 將上述反應液點樣于新華3號濾紙上，同時點樣0. 5% L-丙氨酸標準溶液作為陽 性對照。展開劑為正丁醇：冰醋酸：水=4:1:1，顯色劑為0.5%茚三酮丙酮溶液。首先根 據陽性對照Rf值確定L-丙氨酸斑點位置，然后根據凝膠成像系統和圖像分析軟件分析斑 點的顏色深淺，進而確定菌株生物轉化生成L-丙氨酸的能力。
[0049] 選取斑點最大顏色最深的一株菌進行搖瓶發酵試驗，進一步確認酶活性。
[0050] 四、搖瓶發酵結合氧化顯色法確認酶活性
[0051] 1、搖瓶發酵培養
[0052] 搖瓶發酵培養基配方：葡萄糖3%，蛋白胨1 %，酵母粉0. 2%，NaCl 1. 5%，ΚΗ2Ρ04 0. 05 % , K2HP04 · H20 0. 14 %, MgS04 · 7H20 0. 03 %, CaCl2 0. 05 %, pH 8. 5-9. 0 〇
[0053] 將搖瓶發酵培養基121°C滅菌20min，冷卻后分裝于1L三角瓶中，250mL/瓶。
[0054] 2、生物轉化
[0055] 生物轉化液：L-天冬氨酸 2%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，ρΗ8· 5-9. 0。
[0056] 生物轉化反應：將步驟三復篩得到的高產菌株接種到搖瓶發酵培養基，30°C恒溫 搖床培養24h，振蕩速度轉速150轉/分鐘。離心收集菌體，用生物轉化液洗滌后再與50mL 生物轉化液混合，30°C孵育24h，離心后取上清液氧化顯色法測定酶活性。
[0057] 3、氧化顯色法測定酶活性：
[0058] 參考《藥物生物技術》1996, 3 (2) : 105-108 "氧化顯色法測定L-天冬氨酸-β -脫 羧酶活力"，酶活單位定義為：采用所述文獻操作方法，每克濕細胞每小時催化生成1微克 分子的L-丙氨酸為一個酶活力單位1U。最終測得本實施例的酶活為83. 5U。
[0059] 實施例2對實施例1所得L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌的菌種鑒定
[0060] 一、菌株形態及生理生化特征鑒定
[0061] 參照《常見細菌系統鑒定手冊》的方法，對菌株進行菌株形態及生理生化特征鑒定
[0062] 1、菌體形態特征實施例1所得L-天冬氨酸β_脫羧酶產生菌為革蘭氏陰性菌，細 胞呈短桿狀，極端鞭毛，無芽孢；在肉湯瓊脂平板上可形成扁平的圓形菌落，呈微黃色，表面 較粗糙，陳舊培養物有臭味。
[0063] 2、生理生化特征鑒定結果如表1所示。
[0064] 表1 L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌的生理生化特征
[0065]
[0066] 二、菌株16S rDNA序列分析
[0067] 將菌株在LB培養基中培養過夜后，用溶菌酶裂解法提取細菌總DNA，委托上海生 工生物工程技術服務有限公司進行16S rDNA測序。將測得16S rDNA序列與GenBank數據 庫中相關種、屬的序列比較，進而確定該菌株為惡臭假單孢菌（Pseudomonasputida)。
[0068] 實施例3對比例：生物轉化生產L-丙氨酸的性能考察
[0069] 本對比例考察了試驗菌株與對照菌株轉化生產L-丙氨酸的性能差異。其中試 驗菌株為實施例1篩選到的高產菌株對照菌株惡臭假單孢菌（Pseudomonas putida), 對照菌株Pseudomonas dacunhae購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號 1511C0005000003137,該菌株是L-丙氨酸的生產菌株。
[0070] 1、搖瓶發酵培養
[0071] 搖瓶發酵培養基配方：葡萄糖3%，蛋白胨1 %，酵母粉0. 2%，NaCl 1. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，MgS04 · 7H20 0· 03%，CaCl2 0· 05%，pH 6· 5-7. 0。將搖瓶發 酵培養基121°C滅菌20min，冷卻后分裝于1L三角瓶中，250mL/瓶。然后將分裝好的培養基 分別接種試驗菌株與對照菌株，30°C恒溫搖床培養24小時，振蕩速度轉速150轉/分鐘。
[0072] 2、生物轉化反應
[0073] 向試驗菌株發酵液與對照菌株發酵液中添加 10g L-天冬氨酸，30°C孵育72h，分 別在添加1-天冬氨酸1211、2411、4811、7211后取樣，測定樣品？!1值，并采用實施例1步驟四所 述氧化顯色法測定酶活性。測定結果如表2所示。結果表明隨著轉化反應的進行，試驗菌 株與對照菌株的發酵液pH值都不斷上升，然而對照菌株的酶活性不斷下降，轉化72h后酶 活降至初始酶活的30%，而試驗菌株的酶活比較穩定，轉化72h后酶活僅降低14%，表現了 優異的耐堿性與穩定性。
[0074] 表2試驗菌株與對照菌株酶活對照表 [00751
【主權項】
1. 一種L-天冬氨酸β-脫羧酶產生菌的高通量篩選方法，包括如下步驟： 1) 采用富集培養基對樣品中的微生物進行富集培養與初步分離； 2) 將步驟1)分離得到的單菌落穿刺接種微孔板初篩半固體培養基，培養后根據培養 基的渾濁程度篩選L-天冬氨酸β -脫羧酶產生菌； 3) 將步驟2)初篩得到的菌株接種微孔板液體培養，收集菌體進行生物轉化，采用紙層 析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β -脫羧酶高產菌株； 4) 將步驟3)復篩得到的高產菌株進行搖瓶發酵培養，收集菌體進行生物轉化，然后氧 化顯色法測定L-天冬氨酸β -脫羧酶酶活性。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于： 步驟1)中，所述微生物樣品來自海綿、珊瑚、海底淤泥，所述富集培養基含有質量百分 含量 1% -2%的 NaCl ; 步驟2)中，所述初篩半固體培養基含有質量百分含量0. 05%的CaCl2 ; 步驟3)中，所述生物轉化的操作方式為：將步驟2)初篩得到的菌株接種到復篩培養 基，20°C _37°C恒溫培養后離心收集菌體，與生物轉化液混合，混合物20°C _37°C孵育12-24 小時； 步驟4)中，所述生物轉化的操作方式為：將步驟3)復篩得到的菌株接種到搖瓶發酵 培養基，20°C -37°C恒溫培養后離心收集菌體，與生物轉化液混合，混合物20°C -37°C孵育 12-24小時。3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟1)中所述富集培養的方式 為：將微生物樣品用富集培養基洗滌三次，然后接種到富集培養基，溫度20°C -37°C、轉 速100-200轉/分鐘振蕩培養2-4天；所述富集培養基各組分的質量百分含量為：牛肉膏 〇· 5 %，蛋白胨 1 %，酵母粉 0· 2 %，ΚΗ2Ρ040 · 05 %，Κ2ΗΡ04 ·Η200· 14 %，NaCl 1. 5 %，ρΗ8· 5-9. 0。4. 根據權利要求1或2中所述的方法，其特征在于：步驟3)中，所述復篩培養 基各組分的質量百分含量為：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，NaCll. 5%， ΚΗ2Ρ040· 05%，Κ2ΗΡ04 · Η200· 14%，MgS04 · 7Η200· 03%，CaCl20. 05%，ρΗ8· 5-9. 0。5. 根據權利要求1或2中所述的方法，其特征在于：步驟4)中，所述搖瓶發酵培 養基各組分的質量百分含量為：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，NaCll. 5%， ΚΗ2Ρ040· 05%，Κ2ΗΡ04 · Η200· 14%，MgS04 · 7Η200· 03%，CaCl20. 05%，ρΗ8· 5-9. 0。6. 根據權利要求1或2中所述的方法，其特征在于：步驟3)與步驟4)中，所述生物 轉化液各組分的質量百分含量為：L-天冬氨酸2%，ΚΗ 2Ρ040 . 05%，Κ2ΗΡ04 · Η200. 14%， ρΗ8· 5_9· 0〇7. -種初篩半固體培養基，其特征在于：所述初篩半固體培養基各組分的質量百分含 量為：L-天冬氨酸2%，葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母粉0. 2%，NaCll. 5%，ΚΗ2Ρ04 0. 05%， Κ2ΗΡ04 · Η200· 14%，MgS04 · 7Η200· 03%，CaCl20. 05%，瓊脂 0· 8%，ρΗ8· 5-9. 0 ;將所述初篩 半固體培養基分裝于96孔酶標板，制得初篩半固體培養基孔板。8. 權利要求7所述的初篩半固體培養基在對耐堿L-天冬氨酸β-脫羧酶產生菌的高 通量篩選中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種L-天冬氨酸β-脫羧酶產生菌的高通量篩選方法。該方法包括如下步驟：1)采用富集培養基對樣品中的微生物進行富集培養與初步分離；2)然后將平板分離得到的單菌落接種96微孔板初篩半固體培養基，初篩得到L-天冬氨酸β-脫羧酶產生菌；3)對初篩得到的菌株接種24孔板液體培養，結合紙層析法復篩得到L-天冬氨酸β-脫羧酶高產菌株；4)對復篩得到的高產菌株進行搖瓶發酵，結合氧化顯色法確認酶活性。本發明方法適用于L-天冬氨酸β-脫羧酶產生菌的高通量篩選，篩選的菌株具有耐堿性能，在細胞生產過程中避免了繁瑣pH值控制步驟。同時也為同類生物酶產生菌的高通量篩選提供參考。
【IPC分類】C12Q1/527, C12R1/40, C12Q1/04
【公開號】CN105648036
【申請號】
【發明人】李東升, 傅風華, 張淑敏, 楊小平
【申請人】山東國際生物科技園發展有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月17日