一種重組慢病毒在hiv表型耐藥檢測中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及及醫學分子生物學領域，具體涉及了一種重組慢病毒在HIV表型耐藥 檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] 過去的數十年中，多種HIV-1抑制藥物已批準入市，用于HIV感染病人的治療。基于 HIV-1逆轉錄酶和（或）蛋白酶的兩種或多種抑制劑聯合應用的高效抗逆轉錄病毒療法 (HAART)，被公認為是治療HIV感染病人最有效方法之一。它不僅能夠提高HIV感染病人的生 活質量也能降低HIV的感染風險。盡管HAART能夠抑制病毒的復制和降低HIV感染的風險，但 不能清除HIV-1感染者體內的病毒。因此，抗逆轉錄病毒療法會因藥物選擇性壓力下新現的 耐藥毒株而大打折扣。因此，很有必要監測耐藥毒株并對臨床精準抗病毒治療提供指導。
[0003] 目前，對于HIV藥物耐藥性檢測主要有基因型和表型耐藥兩種檢測類型。基因型耐 藥檢測是通過序列分析，能檢出HIV-1靶基因中特定耐藥相關的基因突變，因其操作簡便， 成本低廉，及在線的評估系統的應用，較表型耐藥檢測常用。但是，基因型檢測不能用于解 釋不常見的突變或幾種突變型的混合突變。表型耐藥檢測，能夠在體外測定HIV-1抑制劑作 用下的病毒產量或酶活性，能夠直接測定每種抑制劑的耐藥水平，而無需知曉HIV-1毒株的 基因突變。因此，表型耐藥檢測對于HIV-1感染的病人，特別是為已經多次治療的病人提供 精準的藥物指導是很有意義的。通常情況下，表型耐藥檢測是分離和培養臨床毒株。但是， 這些檢測需要采集獻血者新鮮的外周血單個核細胞，這將耗時耗力。最近，有一些檢測基于 重組病毒的單環感染，或用感染性粒子進行多輪感染。盡管這些檢測用于表型耐藥分析有 巨大的應用前景，但是，由于采用高通量定量螢火蟲螢光素酶表達系統，成本還是很高昂， 再就是可能存在著生物安全問題。
【發明內容】
[0004] 為了解決上述現有技術的不足，本發明提供了一種重組慢病毒在HIV表型耐藥檢 測中的應用，該重組慢病毒安全高效毒副作用小成本低，將其應用于HIV表型耐藥檢測中， 能為臨床上合理有效地選用抗HIV藥物提供重要參考依據。該重組慢病毒帶有的轉移質粒， 其報告基因 Luciferase與ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV啟動子控 制報告基因1^1(^€6瓜86與286代611的表達，使得!11￥-1抑制劑的抗病毒效果能夠簡易地通過 在倒置熒光顯微鏡下觀察到或通過測定熒光素酶活性而獲得，將P〇l區導入后，多種細胞用 具有此轉移質粒的重組慢病毒均可進行耐藥性檢測，通用性強。
[0005] 本發明所要解決的技術問題通過以下技術方案予以實現： 本發明的發明思路基于以下考慮。第一，在艾滋病人臨床治療工作中，表型耐藥檢測能 為患者個體化治療提供參考。但是表型耐藥檢測是分離和培養臨床毒株。但是，以往的檢測 方法存在耗時耗力或是成本高昂，及生物安全性的問題。基于此，發明人開發了一種具有新 的轉移質粒的重組慢病毒，它具有簡易操作性、較好的生物安全性及通用性。
[0006] 一種重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，該重組慢病毒是包裝質粒、包膜質 粒和轉移質粒共轉染293FT細胞或293T細胞后得到的包裝體；其中，所述包裝質粒為 psPAX2m_pol 質粒;所述轉移質粒為 pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen 質粒。
[0007] 進一步地，所述轉移質粒結構如圖1所示。
[0008] 進一步地，所述轉移質粒的構建方法，包括以下步驟:使用BamH I和Κρη I雙酶切 pMD2 ·G質粒，回收酶切產物，收取119bp CMV片段;將pHAGE-EFla-IRES-ZsGreen質粒用BamH I和Κρη I進行雙酶切，回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen片段;將回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA連接酶進行連接，連接成功后，提取的質粒命名為pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質粒；使用Ncol和Xbal雙酶切PGL3_Promoter Vector，回收 1906bp Luciferase片 段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質粒用Ncol和Xbal雙酶切，回收4855bp的片段，將該片段和 Luciferase片段用T4DNA連接酶進行連接;連接成功后，提取的質粒即為pHAGE-CMV-Luc-IRES_ZsGreen〇
[0009] 進一步地，所述p s PAX 2m-p ο 1質粒結構如圖3所示。
[00?0] 進一步地，所述psPAX2m-pol質粒序列如SEQIDNo.6所示。
[0011 ] 進一步地，所述pSPAX2m_pol質粒的構建方法，包括以下步驟： psPAX2載體重建:利用長引物法突變psPAX2載體的酶切位點Agel，獲得psPAX2-l載體； 利用定點突變試劑盒突變PSPAX2-1載體的酶切位點Apal，獲得psPAX2-2載體;Dpnl酶切 psPAX2-2載體，酶切產物轉化XL 10-G0LD感受態細胞，質粒提取，Apal酶切該質粒，挑取酶 切產物鑒定測序，獲得psPAX2m載體，其序列如SEQIDN 0.4所示； psPAX2m-pol質粒構建:利用PCR擴增pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示；用ApaI和 Agel酶切擴增后的pol片段回收并插入psPAX2m載體，得到psPAX2m-p〇l質粒，其序列如SEQ ID No .6所示。
[0012] 進一步地，所述psPAX2-l載體的序列如SEQIDNo.2所示。
[0013] 進一步地，所述psPAX2-2載體的序列如SEQ ID No.3所示。
[0014] 進一步地，所述psPAX2m載體的序列如SEQIDNo.4所示。
[0015]進一步地，所述長引物法突變psPAX2載體所用的引物為Agel-F和Agel-R，其中， AgeI-F：CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC； AgeI-R：CTGCTAGCTA TAGTTCTAGA GGTATCGGTT GTTTCGAGCT TATAG； 模板為 psPAX2，PCR 條件:94 °C 預變性 4min，94 °C 變性 20s、55 °C 退火 20s、72 °C 延伸 lmin， 循環35次，最后72°C延伸5min; 所述利用定點突變試劑盒突變PsPAX2-1載體所用的引物為M-ApaI-F和M-ApaI-R;其 中， M-ApaI-F：GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG M-ApaI-R：CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC； 模板為 psPAX2-l，PCR 條件:95°C 預變性 2min，95°C 變性 30sec，55°C 退火 lmin，68°C 延伸 10min，循環18次。
[0016]本發明具有如下有益效果:一種重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，該重組 慢病毒安全高效毒副作用小成本低，將其應用于HIV表型耐藥檢測中，能為臨床上合理有效 地選用抗HIV藥物提供重要參考依據。該重組慢病毒帶有的轉移質粒，其報告基因 Luciferase與ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV啟動子控制報告基因 Luciferase與ZsGreen的表達，使得HIV-1抑制劑的抗病毒效果能夠簡易地通過在倒置熒光 顯微鏡下觀察到或通過測定熒光素酶活性而獲得，將P〇l區導入后，多種細胞用具有此轉移 質粒的重組慢病毒均可進行耐藥性檢測，通用性強。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發明中轉移質粒的結構圖； 圖2為本發明中轉移質粒的構建方法示意圖； 圖3為本發明中包裝質粒的結構圖； 圖4為本發明中熒光顯微鏡下質粒共轉染情況;其中：左邊一列為載體突變前，病毒感 染293A細胞熒光百分比；右邊一列為載體突變后，病毒感染293A細胞熒光百分比，其中， A與D表示原始病毒液感染293A細胞熒光百分比； B與E表示原始病毒液稀釋10倍后感染293A細胞熒光百分比； C與F表示原始病毒液稀釋100倍后感染293A細胞熒光百分比 結果:從各個梯度百分比可以看出，載體改造后，對病毒的濃度和感染性無影響； 圖5中A~C分別為使用本發明重組慢病毒共轉染293A細胞，抗HIV藥物司他夫定敏感性 與細胞數目、病毒Μ0Ι及病毒感染時間相關實驗結果； 圖6為本發明中重組慢病毒活性滴度情況； 圖7中A~C分別為使用本發明重組慢病毒共轉染TZM-B細胞，抗HIV藥物齊多夫定(D4T) 敏感性與細胞數目、病毒Μ0Ι及病毒感染時間相關實驗結果； 圖8中A~C分別為使用本發明重組慢病毒共轉染huh7.5細胞，抗HIV藥物齊多夫定 (D4T)敏感性與細胞數目、病毒Μ0Ι及病毒感染時間相關實驗結果。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細的說明。
[0019] 本發明一種重組慢病毒系統是利用下述方法構建的，步驟為： (1)轉移質粒的構建 本發明的轉移質粒具有雙報告基因熒光素酶Luciferase與ZsGreen，其具體結構如圖1 所示。Luciferase與ZsGreen為各自獨立表達的蛋白，而非融合蛋白。
[0020]如圖2所示，該轉移質粒的構建方法如下： (1.1) 使用BamH I和Κρη