一種檢測曲霉屬產毒真菌的lamp通用引物及包含該引物的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測曲霉屬產毒真菌的LAMP通用引物以及包含該引物的試劑 盒，同時涉及一種使用包含該引物的試劑盒快速檢測曲霉屬產毒真菌的方法。屬于食品安 全檢測和微生物檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 曲霉屬產毒真菌是常見腐生真菌，多見于發霉的糧食、糧制品及其它霉腐的 有機物上，菌落生長較快，結構疏松，菌體由許多復雜的分枝菌絲構成。曲霉屬是叢 梗孢目、叢梗孢科中的一個屬，產真菌毒素的菌種主要有：黃曲霉（A. flavus)、寄生 曲霉（A. parasiticus)、雜色曲霉（A. versicolor)、煙曲霉（A. fumigatus)、赫曲霉 (Aspergillus ochraceus)、溜曲霉（Aspergillus tamari)、灰綠曲霉（A. glaucus)、構巢曲 霉（A. nidurans)等。這些曲霉菌的有毒次級代謝產物為黃曲霉毒素、雜色曲霉素、煙曲霉 震顫素、赭曲霉毒素等
[0003] 曲霉屬產毒真菌及真菌毒素廣泛地污染農作物、食品及飼料等植物源性產品。有 些真菌能夠直接引起人和動物的疾病，真菌毒素不但會影響人和動物的健康，而且還會造 成十分嚴重的經濟損失。因此急需研究簡便、經濟和可靠的快速檢測技術。本發明主要研 究曲霉屬產毒真菌的快速檢測方法，主要檢測菌種包括黃曲霉、寄生曲霉、雜色曲霉、煙曲 霉和溜曲霉。
[0004] 目前我國對產毒真菌的檢測都是根據菌體形態和顯微鏡下特征進行分類與鑒定， 但是該方法鑒定周期長、時效性差，需要有經驗的專家或實驗人員才能準確分辨，且容易出 現假陽性或假陰性結果，已經遠遠不能滿足高速發展的食品和飼料進出口檢測需求。近些 年來，國內和國外已經開始運用生物化學和分子生物學等方法開始對產毒真菌進行檢測。 PCR基礎上發展而來的環介導等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，是由日本榮研株式會社的Notomi等人于2000年開發出來的一種新型核酸擴增方 法。它依賴于4條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、 快速、高特異地擴增靶序列。這種鏈置換型的DNA聚合酶，使模板兩端的引物結合處循環出 現環狀單鏈結構，保證引物順利的與模板結合，進行鏈置換擴增反應。該技術更克服了需要 反復熱變性的PCR反應的特點，有效避免了升降溫的過程當中耗時的缺點，實現了恒溫條 件下的連續快速擴增，可以在15_60min之內擴增10 9-101(]倍靶序列拷貝。擴增產物檢測快 速簡單，方法多樣，主要有肉眼觀察沉淀法、熒光染料檢測法、瓊脂糖凝膠電泳法和濁度儀 檢測法。LAMP具有擴增效率高，靈敏度強，特異性好的優點，而且不需要昂貴的PCR儀和試 劑，只需要一個恒溫加熱裝置即可，成本低，適用于在基層使用，在普通的實驗室具有很好 的應用前景，適用于曲霉屬產毒真菌的檢測。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了一種檢測曲霉屬產毒真菌的LAMP通用引物，和一種包含該引物的 試劑盒，以及一種使用該試劑盒檢測曲霉屬產毒真菌的LAMP方法，可以快速、特異、簡便、 廉價的檢測曲霉屬產毒真菌，從而彌補現有技術在相關檢測方面速度慢、成本高等不足，對 農作物、食品、某些藥品及飼料安全檢測具有重要作用。
[0006] 為解決以上技術問題，本發明是通過下述技術方案來實現的：
[0007] -種檢測曲霉屬產毒真菌的LAMP通用引物，其特征在于，其中包括：
[0008] 外側正向引物 F3 :5' -TTGGTGGTGGTATTGCCAA-3' ；
[0009] 外側反向引物 B3 :5' -GACGTGCATGTTGAGGCC-3' ；及
[0010] 內側正向引物 FIP :5 ' -CAGAACAGGGGCGACCTCAC-CTTCACCAACGTTGCTTCGA-3 ' ；
[0011] 內側反向引物 BIP :5' -AGCACAAGGTCCAGATCTGGGT-TCCTCACCAACGGACTTGA-3' ；
[0012] 以及環引物 LF :5' -GCACGGATGACACCCTTG-3' ；
[0013] 環引物 LB :5，-CCGTCGTGCTGGTCCTA-3，。
[0014] -種包含上述LAMP通用引物的檢測曲霉屬產毒真菌的試劑盒，包括LAMP引物、 BstDNA聚合酶、含dNTPs的反應緩沖液和去離子水，其特征在于，其中包括的LAMP通用引物 為上述的LAMP通用引物。
[0015] 上述的檢測曲霉屬產毒真菌的試劑盒，其特征在于，所述的含dNTPs的反應緩沖 液包含（1犯1^2.8111111〇1/1、40111111〇1/1?!18.8的1^8-!1(：1、20111111〇1/11((：1、20111111〇1/1(順 4)2504、 16臟〇1八]\%304、0.2%吐溫20以及1.61]1〇1八甜菜喊。
[0016] 上述的檢測曲霉屬產毒真菌的試劑盒，其特征在于，所述的LAMP通用引物包括 40pmol/y L 引物 FIP50y L、40pmol/y L 引物 ΒΙΡ50μ L、5pmol/y L 引物 F3 50μ L、5pmol/ μ L 引物 B3 50 μ L、20pmol/ μ L 引物 LF50 μ L、20pmol/ μ L 引物 LB50 μ L。
[0017] 上述的檢測曲霉屬產毒真菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中Bst DNA聚合酶 的濃度為8U/μ L，含量為50 μ L，含dNTPs的反應緩沖液含量為lmL，去離子水含量為lmL。
[0018] -種利用上述的試劑盒檢測曲霉屬產毒真菌的方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0019] (1)提取模板 DNA;
[0020] (2)以步驟⑴中提取的DNA為模板，采用上述的檢測曲霉屬產毒真菌的試劑盒進 行LAMP擴增反應；
[0021] (3) LAMP擴增結果判定。
[0022] 上述的檢測方法，其特征在于，步驟（2)中的LAMP擴增反應體系為25 μ L，各組分 含量如下：
[0023] 模板DNA 2pL 40pmol/VL 引物 ΠΡ lpL 40 pmol/pL 引物 BIP l(xL 5 pmol^iL 引物 F3 ΙμL 5 pmol/pL 引物 B3 ΙμL 20pmol/pL 引物 LB 1成 20 pmol/pL 引物 LF 1 μL 含dNTP的反應緩沖液 12.5|iL DNA聚合酶 l|〇L dd Η20 3.5μL。
[0024] 上述的檢測方法，其特征在于，步驟（2)所述LAMP擴增反應的溫度為63°C，時間為 60min〇
[0025] 上述的檢測方法，其特征在于，步驟（3)利用LA-320C濁度儀進行LAMP擴增反應， 通過程序顯示的渾濁度鑒定所述步驟（2)中特異性擴增產物的存在。
[0026] 本發明的上述技術方案相比現有技術具有以下優點：
[0027] 1.本發明所述的檢測曲霉屬產毒真菌的LAMP通用引物及包含該引物的試劑盒， 在檢測曲霉屬產毒真菌時快速和高效：核酸擴增在lh內即可完成，并且可檢測出多種類的 曲霉屬產毒真菌。有發明專利（授權公告號CN101381771B)涉及一種產黃曲霉毒素真菌環 介導等溫擴增快速檢測方法，該方法僅是針對產黃曲霉毒素的真菌的檢測，而本發明的優 點是可以檢測出曲霉菌屬中能夠產生真菌毒素的真菌，非針對于個別真菌毒素基因序列的 檢測。因此本發明可檢測出曲霉屬產毒真菌的污染，對曲霉屬產毒真菌污染的預防和檢測 具有重要意義。
[0028] 2.本發明所述的一種檢測曲霉屬產毒真菌的LAMP通用引物及包含該引物的試劑 盒，所述LAMP通用引物以曲霉屬產毒真菌共有的ATP檸檬酸裂解酶基因為靶基因進行擴 增；該基因序列在曲霉屬產毒真菌中具有高度的同源性，相對于其他真菌具有高度特異性， 因而可以實現曲霉屬產毒真菌的特異性檢測。
[0029] 3.本發明所述的LAMP法檢測曲霉屬產毒真菌，針對靶序列的6個區域設計了 4種 特異性引物，6個區域中任何一處與引物不匹配均不能進行核酸擴增，且與其它種屬的真菌 不發生擴增反應，因而具有高特異性；同時本方法具有高靈敏度，所需模板拷貝量少，檢測 下限約為lxl〇 12g/yL。
[0030] 4.本發明所述的LAMP反應可操作性強，避免使用昂貴的熱循環儀，只要求簡單的 恒溫的反應儀器，必要時只準備恒溫的水浴加熱即可完成此操作；并且產物檢測方便，通過 肉眼觀察渾濁度就能實現；所述包含該引物的試劑盒中所用的檢測試劑均為市售常見化工 試劑，檢測便利。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發明實施例3中LAMP通用引物組檢測曲霉屬產毒真菌擴增曲線圖。橫 坐標代表反應時間（min)，縱坐標代表濁度。圖中曲線為本發明中的5種曲霉屬產毒真菌。
[0032] 圖2為本發明實施例4中LAMP通用引物反應特異性分析的實時濁度檢測擴增柱 狀圖，橫坐標代表反應時間（min)，縱坐標代表濁度。1為黃曲霉；2為禾谷鐮刀菌；3為茄鐮 孢菌；4為島青霉菌；5為鮮綠青霉菌；6為金黃色葡萄球菌；7為大腸桿菌；8為陰性對照
[0033] 圖3為本發明實施例4中LAMP通用引物反應特異性分析的實時濁度檢測擴增曲 線圖，橫坐標代表反應時間（min)，縱坐標代表濁度。圖中曲線為黃曲霉擴增曲線，其它菌種 未發生擴增反應。
[0034] 圖4為本發明實施例5中LAMP通用引物反應靈敏度分析的實時濁度檢測擴增柱 狀圖。橫坐標代表反應時間（min