)，縱坐標代表濁度。左1為10 8 ;左2為10 9左3為10 ; 左4為10 11 ;左5為10 12 ;左6為10 13 ;左7為10 14 ;左8為10 15 ;右1為10 16 ;右2為10 17 ; 右3陰性對照。
[0035] 圖5為發明實施例6中LAMP通用引物反應恒溫水浴實驗的可視化結果。1為系統 陽性照；2為黃曲霉；3為奇生曲霉；4為溜曲霉；5為煙曲霉；6為雜色曲霉；7為陰性對照。
【具體實施方式】
[0036] 實施例1用于檢測曲霉屬產毒真菌LAMP通用引物的設計與合成
[0037] 選取5種曲霉屬產毒真菌所共有的ATP檸檬酸裂解酶基因，根據NCBI比對結果， 選取共有序列區域設計引物。使用LAMP法引物設計支持軟件PrimerExplorer設計引物， 在線設計網址為：http ://primerexplorer. jp/e/。通過篩選選取一套符合LAMP引物設計 要求的引物。所述引物包括2條外側引物（F3、B3)，2條內側引物（FIP、BIP)和2條環引物 (LF和LB)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。ATP檸檬酸裂解酶基因可作為鑒 定曲霉屬產毒真菌的通用基因。
[0038] 實施例2曲霉屬產毒真菌基因組DNA模板的制備
[0039] 使用改良的CTAB法提取基因組DNA。黃曲霉菌（40536)、寄生曲霉菌（40365)、 溜曲霉菌（30585)、煙曲霉菌（3. 5835)和雜色曲霉菌（2474)標準菌株由遼寧出入境檢驗 檢疫局提供。詳細步驟為：（1)取一定量菌絲體于研缽中，液氮研磨成粉末狀后迅速轉移 至lj 1. 5mL 離心管中；（2)加入 600 μ L 預熱的 CTAB 溶液（2 % CTAB，200mmol/L Tris-HCl， 20mmol/LEDTA pH = 8.0，1.4mmol/L NaCl，l%PVP-40,0.2% β-巰基乙醇），迅速蓋緊管 蓋，充分震蕩，65°C水浴30min，期間不斷震蕩；（3)室溫冷卻后加入等體積的酚-氯仿-異 戊醇（25 : 24 : 1)，反復顛倒混勻lmin，13000r/min離心10min;(4)吸取上清于另一離心 管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（24 : 1)，反復顛倒混勻lmin，13000r/min離心10min; (5)吸取上清于另一離心管中，加入SyLlOmg/L的RNaseA溶液，37°C水浴lh ;(6)重復步驟 (3)、（4) ; (7)吸取上清于另一離心管中，加入0. 7倍體積的異丙醇和1/5倍體積的5mol/L 的NaCl溶液，顛倒混勻，4°C沉淀后4°C、13000r/min離心10min ; (8)去上清，加500 μ L70 % 乙醇清洗沉淀，4°C、13000r/min離心10min，去上清后倒扣于濾紙上，吸收管口和管壁殘留 的溶液，放置干燥DNA，干燥時間為15min左右；（9)加入50 μ LTE緩沖液溶解基因組DNA， 于-20°C冰箱保存。
[0040] 實施例3利用LAMP通用引物檢測曲霉屬產毒真菌
[0041] 將黃曲霉、寄生曲霉、溜曲霉、煙曲霉和雜色曲霉作為樣本，按照LAMP反應體系進 行擴增，驗證LAMP通用引物檢測曲霉屬產毒真菌的時間和溫度。分析LA-320C程序的出峰 時間，如圖1所示。從圖1可以看出，LAMP通用引物在10-llmin之間內5種真菌全部開始 發生擴增反應，反應溫度適宜。
[0042] 實施例4利用LAMP通用引物檢測曲霉屬產毒真菌的特異性分析
[0043] 將屬間的禾谷鐮刀菌、茄鐮孢菌、島青霉菌、鮮綠青霉菌以及金黃色葡萄球菌和大 腸桿菌等作為樣本，進行特異性檢驗，按照LAMP反應體系進行擴增，以黃曲霉為陽性對照， 驗證曲霉屬產毒真菌通用引物組合的特異性。分析LA-320C程序的出峰時間及峰值，如圖2 和圖3所示。從圖2和圖3可以看出，引物只與黃曲霉呈陽性反應，與屬間禾谷鐮刀菌，茄 鐮孢菌、島青霉菌以及金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無擴增反應發生，證明曲霉屬產毒真 菌通用引物組合有較好的特異性。
[0044] 實施例5利用LAMP通用引物檢測曲霉屬產毒真菌的靈敏度分析
[0045] 以黃曲霉為模板，將黃曲霉模板DNA按10n比例分別稀釋到10 8、10 9、10 '10 n、 10 12、10 13、10 14、10 15、10 16、10 17倍的十個梯度，單位為g/ μ L。分別取各稀釋度的2 μ L進 行LAMP實驗，驗證LAMP法的靈敏度，確定LAMP法檢測曲霉屬產毒真菌的最低檢測濃度。 分析LA-320C程序的峰值，如圖4所示。從圖4可以看出，黃曲霉基因組DNA模板稀釋到 1 X 10 12g/ μ L后也可檢測到擴增反應發生，靈敏度達到皮克級別。
[0046] 實施例6利用LAMP引物檢測曲霉屬產毒真菌的恒溫水浴實驗
[0047] 對曲霉屬產毒真菌的檢測進行恒溫水浴實驗，按照反應體系加入本發明的LAMP 引物，進行恒溫水浴實驗。反應條件為水浴恒溫63°C，反應60min。通過觀察渾濁度判斷是 否有擴增發生。如圖5所示。通過恒溫水浴實驗發現，在63°C恒溫水浴的情況下，經過一定 的反應時間，5種曲霉屬產毒真菌反應管中均出現混濁現象，說明本發明中曲霉屬產毒真菌 的LAMP通用引物組可在恒溫水浴的條件下發生擴增反應。恒溫水浴實驗證明了 LAMP反應 不需要特殊的儀器而且操作方便的特點。檢測結果直接用肉眼就可以觀察，不需要大型的 儀器進行實驗結果檢驗。
[0048] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非對實施方式的 限定。對于所屬領域的技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變 化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變 化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。
【主權項】
1. 一種檢測曲霉屬產毒真菌的LAMP通用引物，其特征在于，其中包括：外側正向引物F3: 外側反向引物B3 : 內側正向引物FIP 內側反向引物BIPW及環引物LF 環引物LB ;5' -2. -種包含權利要求1中所述LAMP通用引物的檢測曲霉屬產毒真菌的試劑盒，包括 LAMP通用引物、Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反應緩沖液和去離子水，其特征在于，其中包括 的LAMP通用引物為權利要求1中所述LAMP通用引物。3. 根據權利要求2所述的檢測曲霉屬產毒真菌的試劑盒，其特征在于，所述的含dNTPs 的反應緩沖液包含 dNTPs2. 8mmol/L、40mmol/L P冊.8 的化13-肥1、20臟〇1/1 KCl、20mmol/ 1^(畑4)25〇4、16111111〇1/11拆〇4、0.2%吐溫20^及1.6111〇1/1甜菜堿。4. 根據權利要求2所述的檢測曲霉屬產毒真菌的試劑盒，其特征在于，所述的LAMP 通用引物包括 40pmol/U L 引物 FIP50 U L、40pmol/U L 引物 BIP50 U L、5pmol/U L 引物 F3 50y L、5pmol/y L 引物 B3 50y L、20pmol/y L 引物 LFSOy L、20pmol/y L 引物 LBSOy L。5. 根據權利要求2所述的檢測曲霉屬產毒真菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中 Bst DNA聚合酶濃度為8U/ U L，含量為50 U L ;含dNTPs的反應緩沖液含量為ImU去離子水 含量為ImL。6. -種利用權利要求2中所述的試劑盒檢測曲霉屬產毒真菌的方法，其特征在于，包 括W下步驟： (1)提取模板DNA ; 似W步驟（1)中提取的DNA為模板，采用權利要求2中所述的檢測曲霉屬產毒真菌的 試劑盒進行LAMP擴增反應； (3) LAMP擴增結果判定。7. 根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，步驟（2)中的LAMP擴增反應體系為 25 各組分含量如下： 模板DNA 2咕 40pmol心L 引物 FIP I^iL 40 pmol/曲引物 BIP IpL 5 pmol/|xL 引物 F3 1[jL 5pmol4iL 引物 B3 I山L 20 pmol/陣引物 LB 1 |xL 20pmol/咕引物 LF InL 含dNTP的反應緩沖液 12.5|xL 化f DNA聚合酶 l^lL 加 H20 3.5^lL。8. 根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，步驟（2)所述LAMP擴增反應的溫度 為63°C，時間為60min〇9. 根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，步驟（3)利用LA-320C濁度儀進行 LAMP擴增反應，通過程序顯示的渾濁度鑒定所述步驟（2)中特異性擴增產物的存在。
【專利摘要】本發明涉及一種檢測曲霉屬產毒真菌的LAMP通用引物及包含該引物的試劑盒。本發明所述的LAMP引物包括內引物FIP和BIP，外引物F3和B3，以及環引物LF和LB；所述試劑盒包括所述LAMP引物、Bst？DNA聚合酶、含dNTPs的反應緩沖液和去離子水。本發明將環介導等溫擴增技術用于曲霉屬產毒真菌的快速檢測，可以快速、準確、方便地檢測出曲霉屬產毒真菌，對曲霉屬產毒真菌污染的預防和檢測具有重要意義。本發明所述的檢測方法特異性強，靈敏度較高，檢測下限可達到1×10-12g/μL，反應時間短，可操作性強，不需要昂貴的儀器來實現；并且產物檢測方便，通過肉眼觀察法就能實現，具有很高的實用價值。
【IPC分類】C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11, C12R1/66
【公開號】CN105648038
【申請號】
【發明人】黃耀江, 蔣丹, 靳衛林, 孫雷, 閆強
【申請人】黃耀江, 中央民族大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年8月21日